4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶的合成工藝改進

劉 波，向 建，向胤豪，周紅艷，黃文勝，胡 盛

(湖北民族大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 恩施 445000)

4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶是多種激酶抑制劑，如組蛋白去乙?；?HDAC)、絲裂原活化蛋白激酶作用激酶(MNK)[1]、表皮生長因子受體(EGFR)[2]等。4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶同時抑制HDAC和MNK，可以增強對腫瘤細胞的抗增殖活性，為腫瘤治療提供了新途徑[3]；作為磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑[4-5]，對大鼠NPR-A的半數(shù)有效濃度EC50值達到10 nmol級，是一種新型強效NPR-A激動劑[6]。4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶的前藥和對映異構體亦具有很好的藥學特性，具有較高的免疫抑制活性。4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶具有離子通道(如鈣激活鉀通道SK3)抑制特性，可制成藥物制劑[4,7-10]，用于預防或治療與衰老或壓力相關的疾病、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病、凝血障礙、移植排斥反應、某些炎性疾病、神經(jīng)退行性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)TNF-α相關疾病、病毒性疾病(包括丙型肝炎)、勃起功能障礙、以過度或異常細胞增殖為特征的疾病(癌癥)[5]、潮紅、由線粒體活性增強引起的疾病或障礙等[11]。

4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶(Ⅵ)是4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶類藥物的重要中間體，是MNK和莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合位點激酶(PIM)的雙重抑制劑[12]，其細胞活性IC50值達到了個位數(shù)，具有重要的藥物研究價值。目前，4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶的合成路線(圖1)僅有一條：以2,6-二氯吡啶(Ⅰ)為起始原料，經(jīng)硝化得到3-硝基-2,6-二氯吡啶(Ⅱ)，再經(jīng)氰化亞銅親核取代得到中間體2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶(Ⅲ)，經(jīng)氰基水解、硝基還原得到3-氨基-6-氯吡啶甲酰胺(Ⅳ)，再經(jīng)原甲酸三乙酯環(huán)合得到6-氯吡啶并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮(Ⅴ)，最后經(jīng)三氯氧磷氯代得到目標化合物4,6-二氯吡啶[3,2-d]嘧啶(Ⅵ)。但該合成路線存在路線長、產(chǎn)率低、成本高等問題，限制了其廣泛應用，為此，作者對該合成路線進行改進，并通過1HNMR、ESI-HRMS對中間體和目標化合物結構進行分析，以獲得高產(chǎn)率質量穩(wěn)定的4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶。

圖1 4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶的合成路線Fig.1 Synthetic route of 4,6-dichloropyrido[3,2-d]pyrimidine

1 實驗

1.1 試劑與儀器

石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇，天津富宇精細化工有限公司；甲醇、乙腈，色譜級，美國J.T.Baker公司；異丙醇、四氫呋喃(THF)、N,N-二甲基苯胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、芐基三乙基氯化銨(TEBA)、氰化亞銅、濃硫酸、發(fā)煙硝酸、硝酸鉀，市售；所用試劑均未經(jīng)純化直接使用。

SGW X-4型數(shù)字顯微熔點儀(溫度未經(jīng)校正)，上海精密儀器有限公司；Agilent LC Core System高效液相色譜儀，色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；Bruker AVANCE Ⅲ(600 MHz)型核磁共振波譜儀，TMS為內標；Quattro micro API型三重四級桿串聯(lián)質譜儀(1100 Series LC/MSD Trap)，ESI離子源(噴霧電壓3.5 kV)，美國Agilent公司；ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 合成方法

1.2.1 3-硝基-2,6-二氯吡啶(Ⅱ)的合成

0 ℃攪拌下，將96%發(fā)煙硝酸(50 mL)滴加入裝有98%濃硫酸(100 mL)的250 mL茄型瓶中，滴加完后保溫攪拌30 min；將2,6-二氯吡啶(Ⅰ,15.0 g,102.0 mmol)分批加入到茄型瓶中，升溫至95 ℃，于95～97 ℃保溫反應6 h，TLC監(jiān)測反應進程，展開劑石油醚-乙酸乙酯(10∶1，體積比，下同)，Rf=0.41；冷卻至室溫，倒入500 mL冰水中，冰浴下用30%氫氧化鈉溶液調pH值至中性，析出大量淡黃色固體；抽濾，濾餅水洗(50 mL×3)，烘干，得17.0 g淡黃色固體化合物Ⅱ，不經(jīng)純化，直接投入下一步。

1.2.2 2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶(Ⅲ)的合成

室溫(25℃)下，依次將NMP(150 mL)、TEBA(1.2 g,5.18 mmol)、化合物Ⅱ(10.0 g,52.0 mmol)加入到250 mL茄形瓶中，升溫至190 ℃緩慢(5 min)加入氰化亞銅(13.9 g,0.156 mol)，保溫反應70 min,TLC監(jiān)測反應進程，展開劑石油醚-乙酸乙酯(5∶1)，Rf=0.25；趁熱倒入乙酸乙酯-冰水(500 mL∶500 mL)混合溶液中，攪拌15 min，析出黃棕色固體；靜置5 min待其分層，分離得乙酸乙酯層；水及固體層繼續(xù)加入乙酸乙酯(250 mL×2)攪拌15 min，分離得乙酸乙酯層；合并乙酸乙酯層，依次用水、飽和氯化鈉溶液各洗滌1遍，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得紅棕色固體；用乙酸乙酯-石油醚(2∶5)重結晶，得6.0 g淡黃色固體化合物Ⅲ。

1.2.3 3-氨基-6-氯吡啶甲酰胺(Ⅳ)的合成

室溫下，將無水乙醇(120 mL)、氯化亞錫(49.3 g,218.6 mmol)依次加入到250 mL茄形瓶中，攪拌溶解后緩慢(1 g·min-1)加入化合物Ⅲ(10.0 g,64.64 mmol)，室溫反應30 min，TLC監(jiān)測反應進程，展開劑石油醚-乙酸乙酯(2∶1)，Rf=0.33；蒸干溶劑使成糊狀，用乙酸乙酯(1 000 mL)溶解，加入飽和碳酸氫鈉溶液(100 mL)，隨后用10%氫氧化鈉溶液調pH值至7～8，析出大量白色固體；抽濾，將濾液分層，有機層依次用飽和碳酸氫鈉溶液(800 mL)、水各洗滌1遍，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得8.7 g黃色固體化合物Ⅳ，不經(jīng)純化，直接投入下一步。

1.2.4 6-氯吡啶并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮(Ⅴ)的合成

室溫下，將化合物Ⅳ(9.3 g,54.4 mmol)、冰乙酸(163 mg,2.72 mmol,0.16 mL)、原甲酸三乙酯(161.2 g,1.09 mol,167 mL)加入250 mL茄形瓶中，140 ℃反應4.5 h，TLC監(jiān)測反應進程，展開劑二氯甲烷-甲醇(20∶1)，Rf=0.30；冷卻至室溫，析出大量固體；抽濾，將濾餅烘干，得9.2 g黃色固體化合物Ⅴ，不經(jīng)純化，直接投入下一步。

1.2.5 4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶(Ⅵ)的合成

室溫下，將化合物Ⅴ(5.0 g,27.47 mmol)、N,N-二甲基苯胺(5.0 g,41.21 mmol,5.2 mL)、乙腈(150 mL)、三氯氧磷(16.9 g,109.9 mmol,10.2 mL)依次加入250 mL茄形瓶中，82 ℃回流攪拌反應3.0 h，TLC監(jiān)測反應進程，展開劑石油醚-乙酸乙酯(2∶1)，Rf=0.45；蒸干溶劑后用二氯甲烷(200 mL)溶解，飽和碳酸氫鈉溶液調pH值至中性，靜置分層，分離得有機層，水層用二氯甲烷(100 mL×2)萃??；合并有機層，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水、飽和氯化鈉溶液(200 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥過夜，蒸干溶劑得黑棕色固體；用300目硅膠作固定相，石油醚-乙酸乙酯(20∶1)作流動相，柱層析得4.5 g白色固體化合物Ⅵ。

2 結果與討論

2.1 化合物的表征

化合物Ⅱ：產(chǎn)率85.3%。

化合物Ⅲ：產(chǎn)率63.4%，純度99.59%，熔點106～108 ℃。1HNMR(600 MHz,DMSO-d6),δ:8.82(d,J=8.8 Hz,1H),8.18(d,J=8.8 Hz,1H)，與文獻[13]報道一致。

化合物Ⅳ：產(chǎn)率93.7%，純度96.21%。ESI-HRMS，m/z：172.025 8 [M+H]+。

化合物Ⅴ：產(chǎn)率93.4%，純度98.96%。ESI-HRMS，m/z：182.011 3 [M+H]+。

化合物Ⅵ：產(chǎn)率82.7%，純度96.90%。1HNMR(600 MHz,DMSO-d6),δ:8.23(s,1H),8.15(d,J=8.6 Hz,1H),7.89(d,J=8.6 Hz,1H)。

2.2 合成工藝的改進

2.2.1 化合物Ⅲ合成工藝的改進

采用原合成工藝，化合物Ⅲ的產(chǎn)率僅25.7%[14]，后處理時使用了大量的甲苯(對皮膚、黏膜有刺激性，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有麻醉作用，且在體內不易代謝失活)，純化時使用柱層析，使得反應不易放大、效率低，導致4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶價格昂貴。因此，有必要對反應溶劑、催化劑、投料比(氰化亞銅與化合物Ⅱ的用量比，以當量計)、反應溫度、后處理方式等進行改進，以提高化合物Ⅲ的產(chǎn)率。

2.2.1.1 反應溶劑對化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響

在化合物Ⅱ用量為2 g、投料比為2.0∶1的條件下，考察二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、NMP、THF等4種反應溶劑對化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響，結果見表1。

表1 反應溶劑對化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響Tab.1 Effect of reaction solvent on yield of compound Ⅲ

由表1可知，以DMSO、THF為反應溶劑時，未能獲得化合物Ⅲ；以DMF為反應溶劑時，化合物Ⅲ產(chǎn)率較低；以NMP為反應溶劑時，化合物Ⅲ產(chǎn)率升至25.7%。

實驗發(fā)現(xiàn)，當加入0.05 eq.TEBA相轉移催化劑提高氰化亞銅在NMP中溶解度時，化合物Ⅲ產(chǎn)率由25.7%升至36.25%。

2.2.1.2 投料比對化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響

以NMP為反應溶劑，加入0.05 eq.TEBA相轉移催化劑，在化合物Ⅱ用量為2 g、反應溫度為180 ℃的條件下，考察投料比對化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響，結果見表2。

表2 投料比對化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響Tab.2 Effect of molar ratio of materials on yield of compound Ⅲ

由表2可知，固定化合物Ⅱ用量，逐漸增加氰化亞銅用量，當投料比由1.5∶1增至4.0∶1時，化合物Ⅲ產(chǎn)率先升高后降低，在投料比為3.0∶1時產(chǎn)率達到最高，為47.3%。因此，將氰化亞銅用量由1.5 eq.調整為3.0 eq.。

2.2.1.3 反應溫度對化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響

以NMP為反應溶劑，加入0.05 eq.TEBA相轉移催化劑，在化合物Ⅱ用量為2 g、投料比為3.0∶1的條件下，考察反應溫度對化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響，結果見表3。

表3 反應溫度對化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響Tab.3 Effect of reaction temperature on yield of compound Ⅲ

由表3可知，當反應溫度為190 ℃時，化合物Ⅲ產(chǎn)率最高，達到63.4%。因此，將反應溫度由原工藝的180 ℃提高到190 ℃。并且，在后處理中用乙酸乙酯-冰水(500 mL∶500 mL)混合溶液代替有毒的甲苯，用乙酸乙酯-石油醚(2∶5)重結晶代替柱層析進行純化，使得后處理過程更簡單方便，安全有效，便于工藝放大。

綜上，確定化合物Ⅲ的合成工藝為：以NMP為反應溶劑、以0.05 eq.TEBA為相轉移催化劑、氰化亞銅用量為3.0 eq.、反應溫度為190 ℃、用乙酸乙酯-冰水(500 mL∶500 mL)混合溶液代替有毒的甲苯、用乙酸乙酯-石油醚(2∶5)重結晶代替柱層析進行純化，化合物Ⅲ產(chǎn)率可提高到63.4%。

2.2.2 化合物Ⅵ合成工藝的改進

采用原合成工藝，化合物Ⅵ的產(chǎn)率僅42.3%，并且以毒害作用較大的三氯氧磷作反應溶劑，回流反應溫度較高，反應劇烈不易控制。因此，有必要對氯代試劑、堿試劑及其用量、反應溶劑、回流反應溫度等進行改進，以提高化合物Ⅵ的產(chǎn)率。

2.2.2.1 氯代試劑對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響

在0.5 eq.N,N-二甲基苯胺為堿試劑、化合物Ⅴ用量為1 g的條件下，分別以三氯氧磷、二氯亞砜為氯代試劑(用量3.0 eq.)合成化合物Ⅵ，結果見表4。

表4 氯代試劑對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響 Tab.4 Effect of chlorinated reagent on yield of compound Ⅵ

由表4可知，以二氯亞砜為氯代試劑時，不發(fā)生反應；以三氯氧磷為氯代試劑時，化合物Ⅵ產(chǎn)率達到42.3%。因此，選擇三氯氧磷為氯代試劑。

2.2.2.2 堿試劑及其用量對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響

以三氯氧磷為氯代試劑，在化合物Ⅴ用量為1 g、反應溫度為106 ℃的條件下，分別以N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、N,N-二甲基苯胺、DMF、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、三乙醇胺(TEA)、無機堿K2CO3作為堿試劑，使之與化合物Ⅴ的物質的量比為1∶0.5合成化合物Ⅵ，結果見表5。

表5 堿試劑對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響Tab.5 Effect of base reagent on yield of compound Ⅵ

由表5可知，以N,N-二甲基苯胺為堿試劑時，化合物Ⅵ產(chǎn)率最高。因此，選擇堿試劑為N,N-二甲基苯胺。

在三氯氧磷為氯代試劑、化合物Ⅴ用量為1.0 eq.(1 g)、反應溫度為106 ℃的條件下，逐漸增加堿試劑N,N-二甲基苯胺用量，考察堿試劑N,N-二甲基苯胺用量對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響，結果見表6。

表6 堿試劑N,N-二甲基苯胺用量對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響Tab.6 Effect of N,N-dimethylaniline dosage on yield of compound Ⅵ

由表6可知，隨著堿試劑N,N-二甲基苯胺用量的增加，化合物Ⅵ產(chǎn)率逐漸升高。綜合考慮，選擇N,N-二甲基苯胺用量為1.5 eq.，此時化合物Ⅵ產(chǎn)率提高到83.6%。

2.2.2.3 反應溶劑對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響

為了避免三氯氧磷作為溶劑，在3.0 eq.三氯氧磷為氯代試劑、1.5 eq.N,N-二甲基苯胺為堿試劑、化合物Ⅴ用量為1 g的條件下，分別以1,4-二氧六環(huán)、DMF、乙腈、二氯甲烷、THF、甲苯、乙酸乙酯作為反應溶劑合成化合物Ⅵ，考察反應溶劑對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響，結果見表7。

表7 反應溶劑對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響Tab.7 Effect of reaction solvent on yield of compound Ⅵ

由表7可知，以乙腈為反應溶劑時，化合物Ⅵ產(chǎn)率最高，達到72.7%。

2.2.2.4 三氯氧磷用量對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響

以乙腈為反應溶劑，在三氯氧磷為氯代試劑、1.5 eq.N,N-二甲基苯胺為堿試劑、化合物Ⅴ用量為1 g、回流反應溫度下合成化合物Ⅵ，考察三氯氧磷用量對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響，結果見表8。

表8 三氯氧磷用量對化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響Tab.8 Effect of phosphorus oxychloride dosage on yield of compound Ⅵ

由表8可知，當三氯氧磷用量為4.0 eq.時，化合物Ⅵ產(chǎn)率達到82.7%。

將回流反應溫度由108 ℃降為82 ℃，反應條件更溫和，操作更安全。

綜上，確定化合物Ⅵ的合成工藝為：以1.5 eq.N,N-二甲基苯胺作為堿試劑、以乙腈作為反應溶劑、回流反應溫度為82 ℃，化合物Ⅵ產(chǎn)率可提高到82.7%。

3 結論

以2,6-二氯吡啶為起始原料，經(jīng)硝化、親核取代、氰基水解、硝基還原、環(huán)合、氯代得到化合物4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶。在中間體2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶的合成過程中，將反應溫度由180 ℃提高到190 ℃，氰化亞銅用量由1.5 eq.調整為3.0 eq.，同時加入芐基三乙基氯化銨作為相轉移催化劑改善氰化亞銅的溶解性，后處理以乙酸乙酯-冰水混合溶液代替甲苯，并且用重結晶法代替柱層析法進行純化，2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶的產(chǎn)率由25.7%提高到63.4%。在最后一步氯代過程中，以1.5 eq.N,N-二甲基苯胺作為堿試劑、用乙腈代替三氯氧磷作反應溶劑、回流反應溫度為82 ℃，避免了三氯氧磷的毒性危險，使得反應更溫和穩(wěn)定，產(chǎn)率由42.3%提高到82.7%。通過對上面兩步反應條件的改進，4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶總產(chǎn)率從8.1%提高到39.1%，該結果對4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶類化合物的合成工藝研究具有重要價值。