宏基因二代測(cè)序技術(shù)在支氣管肺泡灌洗液病原檢測(cè)中的臨床應(yīng)用

任小宏 代繼宏

在兒童呼吸系統(tǒng)疾病中，順位排名第一的疾病分類(lèi)類(lèi)目是肺部感染，是最常見(jiàn)的兒童死因之一[1-2]。據(jù)報(bào)道，我國(guó)每天至少有約1000名左右的5歲以下兒童因感染肺炎而死亡[3]，肺炎死亡原因中與病原體感染相關(guān)占有62%[4]，可見(jiàn)確診兒童肺部感染的病原學(xué)顯得尤為重要。長(zhǎng)期以來(lái)，研究主要依靠傳統(tǒng)病原菌培養(yǎng)，其方法時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低，對(duì)未知病原體無(wú)法檢測(cè)[5]。宏基因二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)可以無(wú)偏倚地檢測(cè)出所有潛在病原體，指導(dǎo)用藥，降低死亡率。故宏基因二代測(cè)序技術(shù)對(duì)重癥或難治性的兒童肺部感染的診斷和治療具有重要價(jià)值。本研究回顧性的分析了部分重癥或難治性的兒童肺部感染患者的灌洗液宏基因二代測(cè)序檢測(cè)的病原學(xué)結(jié)果，為mNGS的臨床應(yīng)用提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2020年1月至2020年10月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院治療的46例重癥或難治性肺部感染患者的臨床資料，包括：年齡、性別、臨床表現(xiàn)、行mNGS檢測(cè)前的住院天數(shù)、行mNGS檢測(cè)前使用丙球、行mNGS檢測(cè)前使用抗生素、影像學(xué)改變、實(shí)驗(yàn)室檢查、傳統(tǒng)培養(yǎng)的病原學(xué)結(jié)果與支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)的病原學(xué)結(jié)果等基本情況，并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析，資料真實(shí)、可靠且準(zhǔn)確。對(duì)于兒童社區(qū)獲得性肺炎(CAP)的診斷標(biāo)準(zhǔn)將按照國(guó)家衛(wèi)生健康委會(huì)同國(guó)家中醫(yī)藥管理局組織制定的2019年版兒童社區(qū)獲得性肺炎診療規(guī)范[6]診斷。

二、方法

1 標(biāo)本采集 支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本：通過(guò)規(guī)范化培訓(xùn)的專(zhuān)業(yè)的支氣管鏡醫(yī)師在全麻下行支氣管鏡檢查及支氣管肺泡灌洗術(shù)，通過(guò)吸收器吸引并獲取支氣管肺泡灌洗液[7]，回收的支氣管肺泡灌洗液分為兩管，分別行支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)和支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)，其樣本量分別不低于3 mL和5 mL。痰液樣本：如果建立了人工氣道，則使用一次性痰液收集器獲取痰液；如果沒(méi)有建立人工氣道，早晨收集痰液，在留痰前用少量水漱口至少3次，然后用力呼吸，咳出深部呼吸道的痰，并將其放入痰盒中，采集的痰液標(biāo)本量不得少于1 mL；標(biāo)本每次收集后均立即進(jìn)行送檢。

2 病原菌檢測(cè) 支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)：本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果利用illumina公司的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品中的病原微生物進(jìn)行全面檢測(cè)和分析，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列進(jìn)行比較，進(jìn)一步確定樣品中可疑的致病微生物。傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)：采用法國(guó)生物梅里埃生產(chǎn)的VITEK 2 COMPACT檢測(cè)儀進(jìn)行病原體鑒定，并根據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行相關(guān)操作。

3 觀察指標(biāo) 觀察患者的臨床資料：性別、年齡、臨床癥狀、行mNGS檢測(cè)前的住院天數(shù)、行mNGS檢測(cè)前使用丙球、行mNGS檢測(cè)前使用抗生素、影像學(xué)改變、實(shí)驗(yàn)室檢查[8]等。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分類(lèi)變量資料采用例數(shù)(構(gòu)成比)表示，使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

回顧性分析2020年1月至2020年10月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院治療的46例重癥或難治性的肺部感染患者的臨床資料，其中男24例(52.2%)、女22例(47.8%)；年齡在2月～15歲之間，平均年齡為7.5歲。

二、支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性率的比較(見(jiàn)表1)

表1 支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性率的比較[n(%)]

通過(guò)表1，可見(jiàn)支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.348，P<0.05)。

三、支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)的病原體分布(見(jiàn)表2)

表2 兩種不同的檢測(cè)方法的病原體分布

42例患者支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，共檢測(cè)到103株病原體，其中有檢測(cè)到細(xì)菌、真菌、病毒、沙眼衣原體。17例患者傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，共檢測(cè)到24株病原體，均為細(xì)菌。分析發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)對(duì)病毒、真菌、細(xì)菌、特殊的病原體檢測(cè)陽(yáng)性率高于傳統(tǒng)培養(yǎng)(見(jiàn)圖1)。

圖1 支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)與傳統(tǒng)培養(yǎng)的病原體種類(lèi)分布

四、支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)與傳統(tǒng)培養(yǎng)在病原體檢測(cè)上的一致性比較(見(jiàn)表3)

表3 支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)與傳統(tǒng)培養(yǎng)病原學(xué)檢測(cè)一致性比較

支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)均陽(yáng)性患者15例，其中2例檢測(cè)的病原體一致，13例檢測(cè)的病原體不一致；27例支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)陽(yáng)性，但傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果陰性；3例支氣管肺泡灌洗液mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果均陰性，可見(jiàn)其一致性差。

五、不同特征患者支氣管肺泡灌洗液mNGS陽(yáng)性檢出率的比較

搜集46例行支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)患者的臨床資料，包括患者性別、年齡、臨床癥狀、行mNGS檢測(cè)前的住院天數(shù)、行mNGS前使用丙球、行mNGS前使用抗生素、影像學(xué)提示肺炎、實(shí)驗(yàn)室檢查等，比較不同特征患者支氣管肺泡灌洗液mNGS陽(yáng)性檢出率。

通過(guò)表4，發(fā)現(xiàn)行支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)前影像學(xué)提示肺炎、PCT有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余指標(biāo)組間差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 不同特征患者支氣管肺泡灌洗液mNGS陽(yáng)性檢出率的比較 [n(%)]

討 論

隨著現(xiàn)代科學(xué)的不斷發(fā)展，在兒童疾病譜中呼吸系統(tǒng)疾病一直位于首位，肺炎成為呼吸系統(tǒng)疾病最多見(jiàn)的[1-2]，而因病原體直接感染而導(dǎo)致兒童死亡的肺炎占62%[4]，兒童肺部感染性疾病對(duì)兒童的身體健康影響巨大，這就需要更先進(jìn)的診療技術(shù)幫助診斷與治療，對(duì)于兒童感染性肺部疾病來(lái)講，最主要的問(wèn)題是如何找到病原學(xué)，從而對(duì)臨床用藥提供幫助，進(jìn)一步提高治療效果，減少死亡率，而既往的檢查有其局限性，mNGS以其高通量、快速檢測(cè)和其高敏感性等優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步在感染性疾病中，起到了重要的作用。

研究結(jié)果顯示支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)和傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為91.3%、36.9%，可見(jiàn)支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)陽(yáng)性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道具有一致性[9-11]，進(jìn)一步說(shuō)明采用支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)可以提高病原體的檢出率。

本研究中，42例患者支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，病原體種類(lèi)分別為：細(xì)菌56株、真菌14株、病毒32株、沙眼衣原體1株；17例患者傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，其中共檢測(cè)到病原體24株，均為細(xì)菌；可見(jiàn)對(duì)病毒、真菌、細(xì)菌、特殊的病原體的檢測(cè)中支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)的陽(yáng)性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，與既往支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)應(yīng)用于病毒、真菌、細(xì)菌、特殊的病原體等方面的相關(guān)報(bào)道一致[9-12]。

本研究中，支氣管肺泡灌洗液mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)在病原體檢測(cè)結(jié)果的一致性比較中，2例檢測(cè)到的病原體一致，主要為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌；13例檢測(cè)到的病原體不一致，在檢測(cè)結(jié)果不一致的例數(shù)中通過(guò)不同的檢測(cè)方法檢測(cè)到的病原學(xué)分布情況(見(jiàn)表5)，可見(jiàn)：在肺炎鏈球菌的檢出中痰培養(yǎng)比支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)檢出率高，而對(duì)卡他莫拉菌的檢出中痰培養(yǎng)比支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)及支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)的檢出率高，在流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌的檢出中支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)比傳統(tǒng)培養(yǎng)檢出率高，在金黃色葡萄球菌的檢出中支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)和灌洗液培養(yǎng)比痰培養(yǎng)檢出率高，支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)比傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)到的病原體種類(lèi)多，同時(shí)傳統(tǒng)培養(yǎng)可能培養(yǎng)出不確定具體病原體而只能確定種類(lèi)的情況，足以顯示其局限性。27例傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)陰性但支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)陽(yáng)性，可見(jiàn)在傳統(tǒng)培養(yǎng)無(wú)法檢測(cè)到的病原體中，支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)具有較高的臨床價(jià)值。另外有1例傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性而支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)陰性，有3例支氣管肺泡灌洗液mNGS及傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，分析灌洗液mNGS檢測(cè)陰性可能的原因：(1)標(biāo)本確實(shí)無(wú)相應(yīng)病原體感染；(2)由于標(biāo)本為支氣管肺泡灌洗液，故支氣管鏡操作者的技術(shù)可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有所影響，需要提高支氣管鏡操作者的技術(shù)水平；(3)檢測(cè)儀器本身對(duì)一些特殊的病原體無(wú)敏感性或檢出率很低，故需進(jìn)一步改進(jìn)儀器；(4)由于我院的支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)最終都是送到院外檢測(cè)機(jī)構(gòu)，這就延長(zhǎng)了送檢時(shí)間，對(duì)支氣管肺泡灌洗液mNGS的檢測(cè)結(jié)果有影響。

表5 檢測(cè)結(jié)果不一致的例數(shù)通過(guò)不同的方法檢測(cè)到的病原學(xué)分布

本研究中，通過(guò)對(duì)臨床資料的分析，比較不同特征患者支氣管肺泡灌洗液mNGS陽(yáng)性檢出率，發(fā)現(xiàn)性別、年齡、臨床癥狀、行mNGS檢測(cè)前住院天數(shù)、行mNGS檢測(cè)前使用丙球、行mNGS檢測(cè)前使用抗生素、實(shí)驗(yàn)室檢查等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而僅影像學(xué)提示肺炎、PCT有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中影像學(xué)提示肺炎比影像學(xué)提示無(wú)肺炎的檢出率更高(95.2%對(duì)50.0%)，可進(jìn)一步表明支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)對(duì)重癥或難治性?xún)和尾扛腥静≡瓕W(xué)檢出有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。但由于本研究的樣本量較少，仍需要較大的樣本量進(jìn)一步研究驗(yàn)證，且本研究的PCT的特征中大部分為PCT≤0.5，故可進(jìn)一步研究PCT與支氣管肺泡灌洗液mNGS陽(yáng)性檢出率的關(guān)系及影響。

結(jié) 論

綜上所述，在支氣管肺泡灌洗液中使用mNGS檢測(cè)可以提高重癥或難治性的兒童肺部感染病原體的檢出率，尤其是在真菌、病毒和特殊的病原體方面。在傳統(tǒng)培養(yǎng)不能檢測(cè)到病原體的患者中，支氣管肺泡灌洗液mNGS可作為一種有效的檢測(cè)方法，指導(dǎo)臨床藥物的應(yīng)用，提高治療效果，減少死亡率。所以，支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)在我國(guó)重癥或難治性的兒童肺部感染的臨床診斷和治療中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。