溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ基因克隆的初步研究

軒中亞，姜 濤，劉洪波，陳修報，楊 健，

（1.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇無錫 214081；2.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，中國水產科學研究院長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價與資源養(yǎng)護重點實驗室，江蘇無錫 214081）

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）是脊椎動物中一組參與適應性免疫反應的基因［1-3］。MHCⅡ基因編碼的MHCⅡ蛋白主要負責細胞外病原體抗原的識別及呈遞給T淋巴細胞［4］；MHC是基因組中多態(tài)性最豐富的區(qū)域之一，一個特點是物種間和物種內的基因座拷貝數的極大差異，從大西洋鱈（Gadus morhua）沒有MHCⅡ基因座到尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）擁 有 超 過10 個 基 因座［5-7］；另一特點是同一物種群體內等位基因間的高度多態(tài)性［8-9］。在MHC基因中，多態(tài)性最豐富的為MHCⅡ基因，而多樣化選擇往往作用于在MHCⅡ基因第二個外顯子中決定等位基因特異性的抗原結合位點，抗原結合位點正是MHCⅡ最高多態(tài)性的來源［8，10］。

刀鱭（Coilia nasus）是一種溯河洄游性的小型魚類，在河口及近海海域生長，每年春季親魚自海區(qū)進入河口上溯至河流平緩的回水灣或者通江湖泊內產卵，在長江流域最遠甚至可上溯至洞庭湖一帶繁殖，繁殖產生的幼魚在淡水中生活一段時間后進入河口或近海區(qū)域生長［11］。一般認為，刀鱭主要是溯河洄游生態(tài)型［11］，然而一些湖泊中也存在著陸封型的刀鱭種群［12］，另外耳石微化學的研究證實了淡水定居型的刀鱭［13］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，實際上刀鱭存在溯河洄游型長頜鱭、淡水定居型長頜鱭、溯河洄游型短頜鱭、淡水定居型短頜鱭以及陸封型湖鱭5種生態(tài)表型［14］。由此可見，刀鱭具有高度的生態(tài)適應性，而淡水定居與溯河洄游型刀鱭應對的疾病及寄生蟲的對策也截然不同。MHCⅡ由α鏈和β鏈構成，其中MHCⅡβ基因的多樣性與外源性抗原（如疾病和寄生蟲）介導的自然選擇具有密切的關系，這為洄游魚類的局部種群適應和分化的研究提供了良好的視角。然而，迄今對于不同生態(tài)型刀鱭的MHCⅡβ基因是否具有多樣化和差異，是否受到選擇作用的影響等問題尚缺乏了解。探索和解決這些問題對厘清刀鱭生態(tài)適應性及其背后的不同類型的疾病和寄生蟲的抗性特征將具有重要意義。

本研究首次對洄游型刀鱭的MHCⅡβ基因進行基因序列克隆，獲得其MHCⅡβ基因全長序列，并通過MHCⅡβ基因編碼的氨基酸序列研究該類刀鱭MHCⅡ基因的系統(tǒng)進化，以期為進一步探討洄游型刀鱭MHCⅡ基因多態(tài)性、種群遺傳多樣性、自然選擇類型及適應機制（如抗病性等）分析提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物為2018年5月在長江鎮(zhèn)江段進行的刀鱭資源調查中捕撈的3尾刀鱭。上頜骨長度均長于頭長（上頜骨／頭長的比率分別為1.12、1.21和1.09），再經耳石微化學確認，全部為溯河洄游型個體，故判定3尾個體為刀鱭的溯河洄游型長頜鱭生態(tài)表型［14］。在漁船上對剛捕離水面的新鮮刀鱭進行取樣。取其腦、鰓、心臟、脾臟、胃、腎臟、肌肉、皮膚、腸、肝臟等組織后，立即浸入RNA保存液，于4℃置放過夜，待組織充分浸潤后再置于干冰中低溫保存，運到實驗室后立即轉入-80℃冰箱中保存。實驗所用的所有解剖器械和玻璃器皿均經180℃烘烤3 h，以滅活RNA酶，使用無RNase的2 mL凍存管存放樣品。

1.2 DNA和總RNA的提取及cDNA模板的制備

基因組DNA提取使用動物組織基因組DNA提取試劑盒（康為世紀），參照說明書進行操作，DNA提取后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。各組織總RNA提取方法參照Trizol reagent（Invitrogen，美國）說明書，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取出的總RNA的完整性，分光光度計測定RNA濃度。取1μg總RNA樣品，使用反轉錄試劑盒ReverTra Ace-α-TM First Strand cDNA Synthesis Kit（TOYOBO，日本）合成第一鏈cDNA。在無RNA酶的PCR管中加入1μg的總RNA（總RNA濃度400ng·μL-1，共2.5μL），和1μL的100μM的oligo（dT）引物，并加入DEPC處理過的滅菌水8.5μL使混合液最終體積為12μL，將上述混合液于65℃處理5 min，然后在冰上立即冷卻1 min。然后再在反應液中依次加入4μL 5X reaction buffer、1μL RiboLock RNase Inhibitor（20 U·μL-1）、2μL 10 mM dNTP mix、1μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase（200 U·μL-1），將其輕輕混勻，并短暫離心后在PCR儀上42℃孵育1 h，之后70℃孵育5 min結束反應。

1.3 MHCⅡβcDNA全長及基因組序列擴增

以反轉錄產物為模板，根據SHEN等［15］公布的轉錄組文庫中MHCⅡβ的相對保守序列，設計引物對擴增中間片段（引物序列見表1，MHCⅡβ partial-F和MHCⅡβpartial-R）。PCR反應條件：首先在94℃下預變性2 min，之后為35個循環(huán)，每個循環(huán)在94℃下變形30 s、55℃下退火30 s、72℃下延伸1 min；最后在72℃下延伸10 min，PCR產物4℃保存。擴增3′端和5′端的巢式引物，根據已獲得的cDNA中間序列分別設計（表1）。

表1 MHC基因克隆反應引物組合Tab.1 Primer pairs of combination used in cloning

使用SUPERSCRIPT II RT酶和引物MHCⅡβ-race-F1對總RNA進行目的基因第一鏈cDNA的合成，對合成的cDNA進行去RNA處理并進行純化。使用TdT酶和dCTP對純化后的cDNA進行末端加上多聚C，再使用引物MHCⅡβ-race-F2和試劑盒里面帶的橋連鉚釘引物AAP對已經加dC尾的cDNA進行PCR第一輪擴增。使用引物MHCⅡβ-race-F3和試劑盒里面帶的橋連通用擴增引物AUAP進行巢式PCR第二輪擴增，將第二輪PCR產物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化，純化后的PCR產物與pMD18T進行連接，轉化后對陽性克隆進行測序，得到5′端序列。使用引物MHCⅡβ-race-R1和UPM，以cDNA為模板進行第一輪PCR擴增。將第一輪PCR擴增產物稀釋50倍，然后用引物MHCⅡβ-race-R2和UPM進行第二輪PCR擴增。將第二輪PCR產物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化后克隆測序，得到3′端序列。

將中間片段、3′-RACE、5′-RACE序列片段進行拼接，根據拼接獲得的溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ基因cDNA序列，在其序列兩端非編碼區(qū)選取保守片斷設計特異引物MHCⅡβ-ORF-F和MHCⅡβ-ORF-R進行ORF驗證，檢驗拼接所得cDNA全長序列。

1.4 序列分析與進化樹的構建

DNAtools 6.0軟件預測MHCⅡβ基因的開放讀碼框，并翻譯成相應的氨基酸序列；在開放型網站NCBI（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）上比對核苷酸同源性；MHCⅡβ基因編碼的蛋白質的分子式、相對分子質量、等電點等基本信息使用網站工具Prot-Param tool（http：／／www.expasy.org／）進行分析；預測跨膜區(qū)位置使用在線軟件TMHMM （http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／），預測信號肽位置使用在線軟件SignalP（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）。采用蛋白二級結構預測及注釋平臺（http：／／smart.embl-heidelberg.de／）進行結構域分析，通過Swiss Model對MHCⅡβ蛋白的三級結構進行預測。

蛋白序列的多重比對使用Clustal X 1.8軟件；與NCBI上下載的其他脊椎動物的MHCⅡβ蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，不同MHCⅡβ蛋白序列的物種及登陸號為：智人（Homo sapiens，AAH24269）、小家鼠（Mus musculus，P18469）、駝背非鯽（Cyphotilapia frontosa，AAA49157）、斑馬魚（Danio rerio，AAA50043）、三刺魚（Gasterosteus aculeatus，AAU01920）、半 滑 舌 鰨（Cynoglossus semilaevis，ACZ69608）、虹 鱒 （Oncorhynchus mykiss，AAD53032）、大黃魚（Larimichthys crocea，ABV48908）、青鳉（Oryzias latipes，BAA94279）、鯉（Cyprinus carpio，CAA88847）、斜 帶 石 斑 魚（Epinephelus coioides，ACU46020）、圓 斑 星 鰈（Verasper variegatus，ADB43564）、大 西 洋 鮭（Salmo salar，CAA49725）、大 西 洋 鯡（Clupea harengus，XP_012688403）、舌齒鱸（Dicentrarchus labrax，CAJ34344）。進化樹由MEGA軟件構建。

2 結果與分析

2.1 溯河洄游型刀鱭MHCⅡβcDNA全長及序列分析

根據SHEN等［15］公布的刀鱭轉錄組數據獲得長度為821 bp的刀鱭MHCⅡβ基因片段，根據這以基因片段的序列設計特異性引物進行驗證。驗證得到長度為689 bp的核心序列片段。在核心序列片段上設計的RACE引物MHCⅡβ partial-F和MHCⅡβpartial-R擴增分別擴增出了長度約為295 bp的3′片段，和長度約為188 bp的5′片段，將刀鱭MHCⅡβ中間片段，3′片段和5′片段序列根據核苷酸序列的重疊部分堿基序列進行拼接，獲得了刀鱭MHCⅡβ的全長cDNA為917 bp，其中，5′非編碼區(qū)長度為23 bp，開放讀碼框（open reading frame，ORF）765 bp，3′非編碼區(qū)長度為129 bp（圖1）。經BLAST比對后發(fā)現(xiàn)刀鱭的MHCⅡβ基因序列與大西洋鯡MHCⅡβ基因相似性達84.20%。根據ProtParam預測，刀鱭MHCⅡβ基因編碼的蛋白質分子質量為28 710.88，等電點為6.53，蛋白分子式為C1309H2006N334O375S9，總平均疏水指數（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.189。經過SignalP分析發(fā)現(xiàn)22-23 號氨基酸為信號肽序列。TMHMM預測的跨膜區(qū)為220-241號氨基酸。應用SMART軟件對MHCⅡβ蛋白進行二級結構預測，結果顯示MHCⅡβ蛋白由1個MHCⅡβ結構域（從第32個氨基酸開始到第107個氨基酸結束）、1個IGc1免疫球蛋白（從第132個氨基酸開始到第203個氨基酸結束）及一個跨膜區(qū)（從第220個氨基酸開始到第241個氨基酸結束）組成（圖2-a）。通過Swiss Model對MHCⅡβ蛋白的三級結構進行預測的結果見圖2-b。

圖1 溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ基因序列及其推導的氨基酸序列Fig.1 MHCⅡβgene sequence and derived amino acid sequences in anadromous Coilia nasus

圖2 溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ蛋白的二級結構（a）和三級結構（b）示意圖Fig.2 Schematic diagram of the secondary structure（a）and tertiary structure（b）of MHCⅡβin anadromous Coilia nasus

2.2 同源性及系統(tǒng)進化樹分析

對本研究溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ氨基酸序列和其他一些硬骨魚類、哺乳動物（鼠和人）的MHCⅡβ氨基酸序列進行比對，同源性分析顯示，刀鱭MHCⅡβ氨基酸序列與同屬于鯡形目的大西洋鯡的同源性最高，為71.79%；與鱸形目的斜帶石斑魚、駝背非鯽、大黃魚的同源性分別為56.69%、58.27%、57.09%，與刺魚目的三刺魚的同源性為52.36%，與鰈形目的半滑舌鰨的同源性為55.12%，與鳉形目的青鳉的同源性為53.94%，與鮭形目的大西洋鮭的同源性為58.66%，與智人及小家鼠的同源性較低，僅為32.09%和33.46%。

由MEGA 7.0軟件基于MHCⅡβ氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹顯示（圖3），刀鱭的MHCⅡβ氨基酸序列與同屬于鯡形目的大西洋鯡進化關系最近，與鱸形目的舌齒鱸、駝背非鯽、斜帶石斑魚、大黃魚，鳉形目的青鳉，鰈形目的圓斑星鰈、半滑舌鰨、刺魚目的三刺魚共同構成了一個支系；而鮭形目的大西洋鮭、虹鱒以及鯉形目的斑馬魚、鯉等形成了另一個支系，與刀鱭MHCⅡβ氨基酸序列的進化關系較遠。硬骨魚類與智人及小家鼠形成了兩個不同的大的分支，進化關系最遠（圖3）。

圖3 基于鄰接法構建的溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ與其他脊椎動物的進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of MHCⅡβin anadromous Coilia nasus and other vertebrates by neighbor-joining method

3 討論

主要組織相容性復合體 （major histocompatibility complex，MHC）在脊椎動物適應性免疫過程中負責抗原識別及抗原遞呈。另外，除了與抗病性相關外，MHC還被認為與性選擇和配偶選擇具有重要聯(lián)系［16-17］。同時，由于MHC是基因組中多態(tài)性最豐富的區(qū)域之一，MHCⅡ又是MHC基因中遺傳多樣性最豐富的區(qū)域，因此也被當做一種分子標記，廣泛用于物種內種群遺傳多樣性和遺傳分化評估［9，18-19］，受到分子育種和分子生態(tài)學研究的重視［20-21］。

全基因序列的克隆和序列結構分析是對基因進行功能分析的基礎。目前，水產動物MHCⅡ基因的克隆與序列分析已有廣泛報道，現(xiàn)已得到多種魚類MHCⅡ類基因cDNA全長［22-24］。本研究使用Race技術首次克隆了洄游型刀鱭MHCⅡβ基因的cDNA全長，結果顯示洄游型刀鱭MHCⅡβ基因全長917 bp，開放閱讀框長度為765 bp，編碼254個氨基酸。通過軟件分析，預測了洄游型刀鱭MHCⅡβ基因編碼蛋白的二級及三級結構（圖2），顯示刀鱭MHCⅡβ蛋白的三維模型具有兩個不同的典型結構域，這與尼羅羅非魚、長吻鮠（Leiocassis longirostris）、舌齒鱸等具有相似的模型結構［25-27］，表明了刀鱭MHCⅡβ蛋白在抗原呈遞性等功能上與其他魚類MHCⅡβ蛋白的相似性。同源性分析和分子系統(tǒng)進化分析的結果顯示，洄游型刀鱭MHCⅡβ氨基酸序列和同屬于鯡形目的大西洋鯡（Clupea harengus）同源性最高，刀鱭與硬骨魚類的同源性高于與哺乳類的同源性；在進化樹上刀鱭與大西洋鯡相鄰，并且與其他硬骨魚類聚在一起，而與哺乳類處于不同的兩枝，這與刀鱭的分類地位相符。

MHCⅡβ基因上的外源性抗原（如疾病和寄生蟲）介導的選擇可能會導致局部種群適應和種群分化，例如CRISPO等［28］對加拿大西部亞伯達省的3個吻鱥（Rhinichthys cataractae）種群的研究發(fā)現(xiàn)，盡管微衛(wèi)星標記在不同的采樣地間沒有體現(xiàn)出種群結構化和距離隔離模式，但是發(fā)現(xiàn)了MHCⅡβ基因經受平衡選擇的證據，因為這些種群中的MHCⅡβ基因的非同義突變相對于中性期望較高。并且，MHCⅡβ基因的平衡選擇主要發(fā)生在同一河流的上下游之間而非不同河流之間，因此推測上下游種群平衡選擇的差異可能是由不同的病原體群落驅動的，以使不同種群能夠適應不同的環(huán)境條件。另外，MARTíNEZ等［29］發(fā)現(xiàn)在洄游型和上游隔離的定居型虹鱒（Oncorhynchus mykiss）之間1個與MHCⅡ基因關聯(lián)的微衛(wèi)星位點上存在歧化選擇。LARSON等［30］發(fā)現(xiàn)紅大麻哈魚（Oncorhynchus nerka）不同產卵生態(tài)類型間MHC的差異是中性標記的30倍，中性遺傳結構較低、空間距離接近，表明不同產卵生態(tài)類型間的基因交流豐富，在這種情況下MHC高度的遺傳分化可能是由強烈的選擇壓力保持的；并且發(fā)現(xiàn)MHC的分化水平不是隨著地理范圍的增大而增加，反而可能是由病原體群落或病原體毒性在精細的地理范圍內的差異導致的。然而，寄生蟲／病原體介導的選擇并不是影響魚類MHC多樣性的唯一變量。SEIFERTOVá等［31］發(fā)現(xiàn)在歐洲圓鰭雅羅魚（Squalius cephalus）中寄生蟲介導的選擇并不是影響其MHCⅡβ多樣性的唯一變量，中性進化進程也是跨種群MHCⅡβ基因多樣性的重要驅動力。

對于刀鱭而言，目前的研究已經表明，洄游型刀鱭在被陸封到太湖、巢湖、洪澤湖和駱馬湖等4個不同的湖泊里之后形成了快速的、平行的淡水環(huán)境適應的基因組機制［32］。ZONG等［32］認為刀鱭染色體LG6和LG22上的兩個染色體倒位區(qū)很可能與陸封型刀鱭的平行淡水適應有關，并且基因富集分析富集到的注釋涉及多種生物過程，如滲透調節(jié)、免疫調節(jié)、生長成熟、運動等過程。其中注釋到的關于免疫調解的基因是否與MHC基因的作用途徑相關，洄游型與陸封型刀鱭之間MHCⅡβ基因是否具有遺傳差異，以及是否經歷過自然選擇等問題，仍需要進一步的研究。