超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 測(cè)定發(fā)酵肉和發(fā)酵蔬菜中5種生物胺

虞太六

（上海華測(cè)品標(biāo)檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201112）

生物胺（Biogenic Amines，BAs）廣泛存在于各種食品中，且水產(chǎn)品、酒類(lèi)產(chǎn)品、肉制品和乳制品等一般發(fā)酵食品中生物胺含量明顯高于非發(fā)酵食品[1]。適量生物胺可促進(jìn)人體的正常生理活動(dòng)，而過(guò)量攝入會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。目前，檢測(cè)食品中生物胺的方法主要有液相色譜法[2]、氣相色譜法[3]、薄層色譜法[4]和毛細(xì)管電泳法[5]。本文用5%高氯酸冰浴超聲提取，離心，取上清液，調(diào)節(jié)pH并定容，經(jīng)正己烷凈化，建立食品中5種生物胺的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜Wat ers Xevo TQ-S，美國(guó)Waters公司；超聲波提取器、恒溫水浴振蕩器、渦旋振蕩器，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。分析天平，美國(guó)Mettler Toledo公司；離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)有限公司；離心管，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；超純水儀，美國(guó)Millipore公司。

乙腈（HPLC級(jí)）、高氯酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、甲酸和甲酸銨（HPLC級(jí)）。尸胺、腐胺、酪胺、組胺和色胺標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞98%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制（1.0 mg/L）。分別準(zhǔn)確稱取適量尸胺、腐胺、酪胺、組胺和色胺分別用水溶解并定容至10 mL，配制成濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4 ℃保存，有效期1個(gè)月。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液（尸胺、腐胺和酪胺： 200 μg/mL；組胺和色胺：20 μg/mL）。準(zhǔn)確移取尸胺、腐胺和酪胺2 mL，組胺和色胺0.2 mL置于10 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，混勻，4 ℃保存，有效期1個(gè)月。

（3）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（尸胺、腐胺和酪胺：2 μg/mL； 組胺和色胺：0.2 μg/mL）。取0.1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液置于10 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，混勻，4 ℃保存，有效期2周。

（4）準(zhǔn)確移取生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（尸胺、腐胺、酪胺濃度為2 μg/mL，組胺和色胺濃度為0.2 μg/mL） 0.050 mL、0.125 mL、0.250 mL、0.500 mL、 1.000 mL、2.500 mL和5.0 mL分別置于10 mL的容量瓶中，用0.5%高氯酸溶液-乙腈溶液（準(zhǔn)確量取25 mL 0.5%高氯酸溶液用乙腈定容至100 mL，混勻）稀釋并定容，其中尸胺、腐胺和酪胺濃度為 10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、 500 ng/mL和1 000 ng/mL；組胺和色胺濃度為1.0 ng/mL、 2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL和100.0 ng/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

稱取2 g試樣（精確至0.01 g）試樣于50 mL刻度離心管中，加入20 mL 5%高氯酸溶液，旋渦 5 min，冰浴超聲20 min，5 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL刻度試管中；樣品殘?jiān)偌尤?0 mL 5%高氯酸溶液重復(fù)提取一次，合并上清液。往上述上清液中加入適量400 g/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至2～3，用0.5%高氯酸溶液定容至 50 mL。取2 mL上述溶液至離心管中，加入2 mL 0.5%高氯酸溶液，加入5 mL正己烷，振蕩混勻，離心，棄去正己烷層；再加入5 mL正己烷凈化，棄去正己烷層。吸取0.25 mL上述溶液至玻璃管中，加入 0.75 mL乙腈，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測(cè)定。

1.4 分析條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters XBridge HILIC色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為含10 mmol/L甲酸銨、0.5%甲酸的水溶液，B為含10 mmol/L甲酸銨、0.5%甲酸的乙腈溶液；流速： 0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度表

（2）質(zhì)譜條件。電離源：ESI+；毛細(xì)管電壓：4.0 kV； 離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；檢測(cè)方式：MS/MS，參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 5種生物胺的MS/MS參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件優(yōu)化

2.1.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

采用內(nèi)標(biāo)法定量，分別以3倍和10倍信噪比（S/N）確定目標(biāo)分析物的檢出限和定量限。測(cè)得發(fā)酵肉和發(fā)酵蔬菜中5種BAs的檢出限為0.001 60～ 0.002 26 mg/kg，定量限為0.008 21～0.182 00 mg/kg。5種BAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.995。

2.1.2 方法的回收率和精密度

采用空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，尸胺、腐胺和酪胺添加水平分別為 2 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg，組胺和色胺添加水平分別為0.2 mg/kg、1.0 mg/kg、5.0 mg/kg，按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)平行測(cè)定6次，外標(biāo)法校正。由表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在添加范圍內(nèi)BAs的平均回收率在79.0%～98.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.80%～8.69%。

表3 分析方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.1.3 實(shí)際樣品測(cè)定

使用建立的方法對(duì)10種發(fā)酵肉和10種發(fā)酵蔬菜中5種BAs殘留進(jìn)行分析。20個(gè)樣品的測(cè)試結(jié)果表明如下。10種發(fā)酵肉中尸胺樣品濃度為ND～ 152 mg/kg，腐胺樣品濃度為ND～96.2 mg/kg，酪胺樣品濃度為ND～344 mg/kg，組胺樣品濃度為ND～484 mg/kg，色胺樣品濃度為ND～39.8 mg/kg。10種發(fā)酵蔬菜中尸胺樣品濃度為ND～132 mg/kg，腐胺樣品濃度為ND～122 mg/kg，酪胺樣品濃度為ND～194 mg/kg，組胺樣品濃度為ND～55 mg/kg，色胺樣品濃度為ND～2.55 mg/kg。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)測(cè)定發(fā)酵肉和發(fā)酵蔬菜樣品中5種BAs殘留的分析方法。該方法的線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度均能滿足殘留分析要求，其前處理方法簡(jiǎn)單、凈化效果良好，適用于大量發(fā)酵食品樣品中5種BAs含量的快速檢測(cè)。