UPLC-PDA測定膽木中異長春花苷內(nèi)酰胺含量

侯倩煜，李飛宇，陳燕艷，楊美華，趙祥升*（.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?5703；.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院＆北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 0093）

膽木為茜草科烏檀屬喬木烏檀（Nauclea officinalisPierrc ex Pitard）的干燥莖、枝、樹皮和根，又稱烏檀、藥烏檀、黃羊木、熊膽樹、山熊膽等，是一味常用的黎藥，收載于《黎族醫(yī)藥》[1-2]。膽木生于高山近頂或半山腰蔭蔽潮濕地帶的雜木林中，分布狹窄且種群數(shù)量少，為中海拔森林中少見的喬木樹種，主要分布于廣東、廣西和海南等地，為我國重點(diǎn)保護(hù)的珍稀野生植物物種，也是海南省珍貴的南藥樹種[3-4]。膽木味苦、性寒，全株可入藥，具有消炎殺菌、清熱解毒、消腫止痛之功效，我國南方民間常用于治療感冒發(fā)熱、肺炎、腸炎、膽囊炎、痢疾、濕疹、皮疹、泌尿系統(tǒng)感染、膿瘍等病癥，外用于癰癤膿腫[2-3]。國內(nèi)臨床目前有膽木注射液、膽木浸膏糖漿和膽木浸膏膠囊等中藥制劑，主要用于急性扁桃腺炎、急性咽喉炎、急性結(jié)膜炎及上呼吸道感染等，療效良好[4]。

膽木中主要有效成分為吲哚類生物堿，其主要為異長春花苷內(nèi)酰胺。異長春花苷內(nèi)酰胺（isovincoside lactone，又名strictosamide）具有抗腫瘤、殺瘧原蟲等活性，是膽木中藥制劑中的主要有效成分，含量較高，是評價(jià)膽木注射液、膽木浸膏糖漿和膽木浸膏膠囊質(zhì)量的指標(biāo)成分[5-7]。目前，文獻(xiàn)多采用高效液相色譜法測定膽木中藥制劑中異長春花苷內(nèi)酰胺含量，但對膽木生藥中該成分的含量測定相對較少，且文獻(xiàn)中報(bào)道主要用藥部位為莖、枝[8]，根、皮和葉的研究較少。為充分利用膽木資源，需探索膽木其他部位異長春花苷內(nèi)酰胺含量，挖掘膽木新的藥用部位。本文采用超高效液相色譜法（UPLC）對膽木的根、枝、皮、葉中異長春花苷內(nèi)酰胺含量進(jìn)行測定，并比較各部位含量高低，探討采集地區(qū)、部位、月份、樹齡對膽木中異長春花苷內(nèi)酰胺含量的影響，以期為膽木藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters H-class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司，帶PDA檢測器）；XS105DU型十萬分之一電子天平、LE203E型千分之一電子天平（上海托利多有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GL-21B型低溫高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BJ-800A型多功能粉碎機(jī)（上海拜杰實(shí)業(yè)有限公司）；Mili-Q型純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

膽木采自海南省五指山、瓊中等地，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所南藥研究中心鑒定為茜草科烏檀屬喬木烏檀Nauclea officinalisPierrc ex Pitard的枝、樹皮、根和葉。異長春花苷內(nèi)酰胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度＞98%，批號：111778-202003）。色譜純的甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（Fisher公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品儲備液的制備

精密稱取異長春花苷內(nèi)酰胺對照品適量，置于5.0 mL的棕色量瓶中，75%甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1070 μg·mL-1的對照品儲備液，4℃保存，備用。不同質(zhì)量濃度的對照品溶液由儲備液稀釋得到。

2.2 供試品溶液的制備

稱取膽木藥材粉末（過二號篩）0.10 g，加入75%甲醇40 mL，稱重，超聲提取45 min（功率500 W，頻率40 kHz），冷卻至室溫，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，離心10 min（3000 r·min-1），取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-純水（B），梯度洗脫（0～7 min，20%～40%A）；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為3 μL；檢測波長為227 nm。在該條件下，對照品及膽木樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）和膽木根（B）、葉（C）、枝（D）、皮（E）樣品的UPLC色譜圖Fig 1 UPLC chromatogram of the reference substance（A）and root（B），leaf（C），branch（D）and bark（E） of Nauclea officinalis Pierrc ex Pitard 1.異長春花苷內(nèi)酰胺（isovincoside lactone）

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系、檢測限與定量限 異長春花苷內(nèi)酰胺對照品儲備液用75%甲醇稀釋為不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝5.298×104X＋3.947×104（R2＝0.9991），線性范圍為0.11～85.60 μg·mL-1。取異長春花苷內(nèi)酰胺對照品儲備液，用75%甲醇逐級稀釋，測定異長春花苷內(nèi)酰胺檢測限（S/N＝3）和定量限（S/N＝10）分別為53.5 ng·mL-1和107.0 ng·mL-1。

2.4.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性 取異長春花苷內(nèi)酰胺質(zhì)量濃度為5.35 μg·mL-1的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得異長春花苷內(nèi)酰胺色譜峰峰面積的RSD為0.98%，表明儀器精密度良好。取同一批膽木（S13）粉末6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)樣測定，記錄峰面積。計(jì)算得異長春花苷內(nèi)酰胺的平均含量為3.132 mg·g-1，RSD為1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣測定，計(jì)算異長春花苷內(nèi)酰胺色譜峰峰面積的RSD為0.32%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 加樣回收試驗(yàn) 稱取6份已知含量的同一批膽木樣品（S13）粉末0.05 g，精密加入適當(dāng)濃度的對照品溶液（相當(dāng)于供試藥材原有含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)的100%）。按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果異長春花苷內(nèi)酰胺的平均加樣回收率（n＝6）為99.77%，RSD為0.13%，表明方法準(zhǔn)確可靠。

2.5 樣品含量測定

分別取不同編號的膽木藥材粉末，依據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，注入U(xiǎn)PLC進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。膽木不同部位的異長春花苷內(nèi)酰胺含量存在差異，根中含量最高（11.42～13.38 mg·g-1），其次為葉（2.03～5.00 mg·g-1），枝中（1.57～3.79 mg·g-1）含量相對較低。該結(jié)果在文獻(xiàn)報(bào)道的膽木異長春花苷內(nèi)酰胺含量范圍內(nèi)（1.68～19.77 mg·g-1）[8-10]。

表1 膽木樣品中異長春花苷內(nèi)酰胺的含量 Tab 1 Content of isovincoside lactone in Nauclea officinalis Pierrc ex Pitard

此外，不同地區(qū)和不同樹齡膽木的枝中異長春花苷內(nèi)酰胺含量存在差異，海南瓊中膽木枝中異長春花苷內(nèi)酰胺含量大于海南五指山（S6～S9），5年生的膽木枝中異長春花苷內(nèi)酰胺含量大于3年、7年和12年生膽木枝（S8～S12）。采集時(shí)間對膽木根和枝樣品中的異長春花苷內(nèi)酰胺含量也存在影響，在5月份采集的膽木根和枝中異長春花苷內(nèi)酰胺含量大于1、3月份（S13～S18）。由此猜測膽木中異長春花苷內(nèi)酰胺含量會隨地區(qū)、植株年齡、采集月份不同等因素發(fā)生波動(dòng)。

3 討論

試驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相（乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-乙酸水溶液）、流速（0.2、0.3、0.4、0.5 mL·min-1）和柱溫（30、40、50、60℃）等對目標(biāo)峰分離度的影響。結(jié)果表明，乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)分離效果好、保留時(shí)間短且基線穩(wěn)定。流速為0.4 mL·min-1可縮短樣品運(yùn)行時(shí)間且柱壓適中。溫度波動(dòng)對異長春花苷內(nèi)酰胺的色譜峰峰面積無較大影響（RSD＝0.62%），本方法優(yōu)選40℃柱溫，分離度和保留時(shí)間都較好。UPLC分析結(jié)果表明，異長春花苷內(nèi)酰胺能在227 nm下得到較好吸收，因此，選擇227 nm作為檢測波長，表觀峰度高、峰形較好且基線穩(wěn)定。

考察了超聲提取和回流提取對提取異長春花苷內(nèi)酰胺含量的影響。結(jié)果顯示兩種方法差異不大，但超聲提取簡便、快速、適合批量提取。試驗(yàn)中優(yōu)化了影響目標(biāo)物超聲提取率的因素：提取溶劑（純水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇），料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）和超聲時(shí)間（30、45、60、90、120 min）等，結(jié)果見圖2。由圖可知，用40 mL 75%甲醇超聲提取45 min時(shí)，異長春花苷內(nèi)酰胺的提取效果最好。

圖2 提取溶劑、溶劑體積和提取時(shí)間對異長春苷內(nèi)酰胺提取率的影響Fig 2 Effect of extraction solvent，volume of solvent and extraction time on extraction efficiency of isovincoside lactone in the Nauclea officinalis Pierrc ex Pitard.

由于膽木原材料逐漸匱乏，為了更加合理地利用資源，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，需探索膽木各部位的藥用價(jià)值。異長春花苷內(nèi)酰胺是膽木中藥制劑中主要有效成分，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽木根、莖、皮、葉中皆含有異長春花苷內(nèi)酰胺，且含量較大，其中膽木根中異長春花苷內(nèi)酰胺含量較高，但采集樹根對膽木樹的傷害較大，故不建議根入藥，現(xiàn)階段運(yùn)用最多的為膽木枝，膽木葉的運(yùn)用較少。膽木葉中異長春花苷內(nèi)酰胺含量高于膽木莖，且膽木葉的采收產(chǎn)量較多、對膽木樹傷害較小。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，膽木葉醇提物（20 g·kg-1）與由膽木莖皮提取的膽木浸膏片（800 mg·kg-1）具有相同的抗炎鎮(zhèn)痛作用，膽木葉提取物有抗氧化活性且對耐甲氧西林葡萄球菌具有很好的抑菌效果[11-13]，但膽木葉的毒理學(xué)還有待研究。

綜上，本研究建立了UPLC測定膽木中異長春花苷內(nèi)酰胺含量的方法，該方法準(zhǔn)確度高，選擇性好，具有較好的重復(fù)性和精密度，適用于膽木中異長春花苷內(nèi)酰胺含量定量分析，可為相關(guān)檢測工作提供參考。