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    miR-7在Oct4調(diào)節(jié)TLR4表達中的作用對結直腸癌細胞生長的影響

    2022-07-03 12:43:30何勁松段亮謝育魏壽江
    中國藥學藥品知識倉庫 2022年13期
    關鍵詞:分子機制結直腸癌

    何勁松 段亮 謝育 魏壽江

    摘要: 目的:探析微小核糖核酸(miR-7)在八聚物(Oct4)調(diào)節(jié)Toll樣受體4(TLR4)表達中的作用對結直腸癌細胞生長的影響。方法:選擇2020年1月-2021年12月,正常腸粘膜(對照組)、結直腸癌(觀察組)臨床樣本中分別獲得的17株和14株亞克隆細胞株。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)結合免疫共沉淀技術,明確Oct4與miR-7、miR-7與TLR4分子層面的靶向調(diào)控關系;觀察雙向調(diào)控下結直腸癌細胞在體及細胞水平生物學功能,探討Oct4-miR-7-TLR4信號通路的分子機制及功能調(diào)控作用。結果:觀察組miR-7檢測值低于對照組,Oct4、TLR4檢測值、雙陽性細胞、平均腫瘤球比高于對照組(P<0.05);miR-7與Oct4、TLR4呈負相關,Oct4與TLR4呈正相關(P<0.05)。結論:Oct4高表達可導致miR-7表達下調(diào),進而致TLR4表達上升,使結直腸癌患者出現(xiàn)miR-7低表達狀態(tài),Oct4、TLR4高表達狀態(tài),結直腸癌細胞生長、繁殖加快,腫瘤惡化程度加重。

    關鍵詞:結直腸癌;細胞生長;水平表達;分子機制;調(diào)控作用

    【中圖分類號】 R574.63 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306(2022)13--02

    [Abstract] Objective: To explore the effect of micrornas (Mir-7) on the growth of colorectal cancer cells by regulating toll-like receptor 4 (TLR4) expression by Oct4. Methods: From January 2020 to December 2021, 17 and 14 subclonal cell lines were selected from clinical samples of normal intestinal mucosa (control group) and colorectal cancer (observation group), respectively. The dual luciferase reporting system combined with immunoprecipitation technique was used to clarify the targeted regulatory relationship between Oct4 and Mir-7, mir-7 and TLR4 at the molecular level. To observe the biological functions of colorectal cancer cells in vivo and at the cellular level under bidirectional regulation, and to explore the molecular mechanism and functional regulation of OCT4-Mir-7-TLR4 signaling pathway. Results: The detection value of Mir-7 in the observation group was lower than that in the control group, while the detection value of Oct4 and TLR4, double positive cells and average tumor ball ratio in the observation group were higher than those in the control group, with statistical significance (P<0.05). The results showed that Mir-7 was negatively correlated with Oct4 and TLR4, while Oct4 was positively correlated with TLR4 (P<0.05). Conclusion: High EXPRESSION of Oct4 can lead to down-regulation of Mir-7 expression, and then increase the expression of TLR4, resulting in low expression of Mir-7 in colorectal cancer patients. High expression of Oct4 and TLR4 can accelerate the growth and reproduction of colorectal cancer cells, and aggravate the degree of tumor deterioration.

    結直腸癌是指源于大腸上皮細胞,發(fā)生在結腸或直腸部位的腫瘤疾病,以便血、排便習慣改變?yōu)榈湫团R床表現(xiàn),可伴尿頻、腹痛、腹脹等癥狀,會對患者的正常生活、工作狀態(tài)造成直接影響,且會危及其生命[1-2]。一般早期結直腸癌患者多無特異性臨床表現(xiàn),易漏診、誤診,錯失最佳診療時期[3]。近年來,隨生物分子學相關研究地深入,靶向治療已成為治療癌癥的新手段,成為國內(nèi)外研究熱點。八聚物(Oct4)是干細胞重編的關鍵因子之一,有抑癌基因和癌基因的雙重作用,同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[4]。微小核糖核酸(miR-7)可通過調(diào)節(jié)多種靶基因的表達,抑制結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[5]。TOLL樣受體家族(TLRs)TLR4在促進結腸黏膜上皮細胞的炎癌轉化過程中發(fā)揮著重要作用,同結直腸癌的發(fā)生有相關性[6]。目前關于Oct4-miR-7-TLR4信號通路調(diào)控影響結直腸癌的研究尚少,所以本研究擬針對miR-7和TLR4在結直腸癌干細胞相關功能調(diào)節(jié)所發(fā)揮的作用,及Oct4調(diào)控結直腸癌干細胞致瘤能力的分子機制展開深入研究探析,以期為靶向結直腸癌干細胞的診治提供新的方向和理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1一般資料

    選擇2020年1月-2021年12月,正常腸粘膜(對照組)、結直腸癌(觀察組)臨床樣本中分別獲得的17株和14株亞克隆細胞株。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)結合免疫共沉淀技術,明確Oct4與miR-7、miR-7與TLR4分子層面的靶向調(diào)控關系;觀察雙向調(diào)控下結直腸癌細胞在體及細胞水平生物學功能,探討Oct4-miR-7-TLR4信號通路的分子機制及功能調(diào)控作用。

    1.2方法

    1.2.1質(zhì)粒構建、獲得亞克隆細胞株

    構建Oct4過表達、miR-7過表達及敲降、TLR4過表達及敲降質(zhì)粒;構建含Oct4核心結合位點的miR-7啟動子區(qū)域熒光素酶報告質(zhì)粒;構建含miR-7靶點的TLR43’UTR熒光素酶報告質(zhì)粒(均含有對照質(zhì)粒)。后通過脂質(zhì)體穩(wěn)定轉染法,獲得結直腸癌細胞系SW620的亞克隆細胞株:Oct4過表達、miR-7過表達、Oct4過表達+miR-7過表達、Oct4過表達+TLR4敲降、TLR4敲降(均包括對照組亞克隆細胞株)。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)、免疫印跡(WB)等實驗檢測上述亞克隆細胞株中相關基因的表達。

    1.2.2驗證表達

    在Oct4過表達細胞株及對照細胞株中轉染具有Oct4核心結合位點(5’-CACCC-3’)的miR-7啟動子序列的熒光素酶報告系統(tǒng),檢測其活性。采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(CHIP)檢測Oct4過表達細胞株及對照細胞株中Oct4與miR-7相關啟動子區(qū)域的結合能力。在miR-7過表達細胞株及對照細胞株中轉染具有miR-7核心結合位點的TLR43’UTR的熒光素酶報告系統(tǒng)及含突變位點的對照系統(tǒng),檢測其活性。在Oct4過表達+miR-7過表達及其對照細胞株中轉染具有miR-7核心結合位點的TLR43’UTR的熒光素酶報告系統(tǒng)及含突變位點的對照系統(tǒng),檢測其活性。最后流式分選上述亞克隆細胞株中結直腸癌腫瘤干細胞(Lgr5+/EpCAM+,CSCs)及對照組(Lgr5-/EpCAM-,non-CSCs),檢測細胞數(shù)目。檢測Oct4/miR-7/TLR4通路對于結直腸癌腫瘤干細胞致瘤能力的影響將上述分選得到的CSCs及non-CSCs細胞亞群按照1個、10個、100個梯度的細胞數(shù)目在體外進行成球實驗,在體內(nèi)進行裸鼠皮下植瘤實驗,檢測結直腸癌腫瘤干細胞的致瘤能力。

    1.2.3裸鼠移植瘤模型步驟

    ①取處于對數(shù)生長期的細胞,收集后用無血清培養(yǎng)基重懸,計數(shù),稀釋至濃度為8×107/ml的細胞懸液。②取適量的細胞懸液與Matrigel等比例混合,利用一次性無菌胰島素注射器取100μ在裸鼠的雙側背部近大腿處進行皮下注射。③觀察瘤子的生長情況,待移植瘤長出后,利用電子游標卡尺每周測量一次,記錄腫瘤的長寬。根據(jù)公式π/6×長×寬2,計算腫瘤的大小。④待腫瘤大小至1,000mm3左右時(注射后30天左右),處死裸鼠,拍照,剝出皮下腫瘤,稱重,按照次序排列整齊后拍照,繪制腫瘤生長曲線,對比兩種細胞的生長能力。

    1.2.4細胞數(shù)檢測

    雙陽性細胞的數(shù)目。過程如下:①消化、離心、PBS重懸。②加抗體:Lgr5--PE,EpCAM--APC雙標篩選結直腸癌干細胞,設空白對照,避光孵育20min。③孵育后每管加入500μl的完全培養(yǎng)基或PBS,1000r/min,離心5-7分鐘,去上清,用含1%FBS,2%P/S的PBS500μl-1000μl重懸,進行上機檢測,觀察陽性細胞數(shù)量。根據(jù)將要接收細胞數(shù)目的多少,準備流式接管,分別收集雙陽性細胞及雙陰性細胞。

    細胞成球實驗過程如下:①細胞消化、離心、重懸、計數(shù)。②50μl完全培養(yǎng)基中1000個細胞與50ulmatrigel混合,這個過程在冰盒上操作。③上述100ul混合液鋪于12孔板中。④放入37度溫箱中,待半小時到一小時左右,凝固后,其上添加1ml完全培養(yǎng)基,防止膠體干掉。每隔兩天換液一次。采用電子顯微鏡觀察細胞的成球能力并拍照。

    1.3 觀察指標

    ①比較兩組的miR-7、Oct4、TLR4表達。②miR-7、Oct4、TLR4在結直腸癌中的相關性。③比較兩組的雙陽性細胞和致瘤情況。

    1.4 統(tǒng)計學方法

    使用SPSS23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,使用t和“x±s”表示計量資料,使用x2和%表示計數(shù)資料,相關性分析采用Pearson相關分析法。P<0.05表示數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1比較兩組的miR-7、Oct4、TLR4表達

    觀察組miR-7檢測值低于對照組,Oct4、TLR4檢測值高于對照組(P<0.05)。見表1。

    2.2miR-7、Oct4、TLR4在結直腸癌中的相關性

    結果顯示,miR-7與Oct4、TLR4呈負相關,Oct4與TLR4呈正相關(P<0.05)。見表2。

    2.3比較兩組的雙陽性細胞和致瘤情況

    觀察組雙陽性細胞、平均腫瘤球比均高于對照組(P<0.05)。見表3。

    3. 討論

    結直腸癌是較常見的一種胃腸道惡性腫瘤疾病,在腫瘤疾病中,結直腸癌發(fā)病率、病死率分別居于第三、第二[7]。流行病學顯示,2018年全球結直腸癌新發(fā)病例達180萬,死亡人數(shù)在88萬左右,整體發(fā)病率、病死率較高[8]。且目前結直腸癌的具體病因尚未明確,難以給予有針對性的治療措施。但隨醫(yī)療技術的提升,近年發(fā)現(xiàn)結直腸癌發(fā)病是多種原癌基因與抑癌基因共同作用的結果,基于結直腸癌發(fā)病的分子機制,針對細胞信號通路尋找治療靶點,行靶向治療已成為國內(nèi)外研究熱點和難點。

    腫瘤干細胞是腫瘤細胞存在的具有自我更新和致瘤特性,對傳統(tǒng)放化療存在抵抗的小部分細胞亞群,此部分細胞雖少,卻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關鍵。分析本研究結果數(shù)據(jù)??赡艿脑蛉缦拢簃iR-7是多種腫瘤的抑癌基因,可作用于多種靶基因。在腫瘤疾病中,miR-7呈高表達狀態(tài),有抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移和細胞周期進程的作用,對促進腫瘤細胞凋亡,控制病情有積極影響。本研究中,結直腸癌者的miR-7呈低表達狀態(tài),可側面說明miR-7表達下降,致腫瘤細胞增殖、生長得不到有效控制,患者病情開始逐漸惡化。Oct4有抑癌基因和癌基因雙重作用,亦是維持胚胎干細胞多能性及自我更新能力的主要調(diào)節(jié)劑。Oct4表達上升,可能會促進腫瘤細胞的增殖分化,可能會通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路,達維持腫瘤干細胞增殖、分化能力,加重結直腸癌病情的目的。TLR4在促進結腸黏膜上皮細胞的炎癌轉化過程中發(fā)揮著重要作用,可通過調(diào)控下游NF-κB等多種基因的表達,來促進結直腸癌的發(fā)生[9]。即TLR4通過促進炎性因子分泌,加重胃腸道炎癥反應,使腫瘤細胞對細胞毒性T淋巴細胞的攻擊產(chǎn)生抵抗,進而促進腫瘤細胞的生長、繁殖,加重腫瘤惡化程度[10]。就Oct4-miR-7-TLR4信號通路的分子機制而言,本研究中,結直腸癌者的miR-7呈低表達,Oct4、TLR4呈高表達,說明Oct4過表達可導致miR-7表達下調(diào),隨miR-7表達下降,結直腸癌失去保護因素,TLR4等危險因素呈上升趨勢。miR-7表達越低,Oct4、TLR4表達越高,結直腸癌干細胞的致瘤能力越強,患結直腸癌的風險越高,腫瘤病變程度越嚴重。

    綜上所述,Oct4高表達可導致miR-7表達下調(diào),進而致TLR4表達上升,使結直腸癌患者出現(xiàn)miR-7低表達狀態(tài),Oct4、TLR4高表達狀態(tài),結直腸癌細胞生長、繁殖加快,腫瘤惡化程度加重。

    參考文獻:

    [1] 萬健,張玉潔,王敏,等.潰瘍性結腸炎相關異型增生和潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌56例的臨床特征[J].中華消化雜志,2021,41(10):660-664.

    [2] 徐恩盼,李冰,周平紅,等.內(nèi)鏡黏膜下剝離術治療超高齡患者結直腸癌前病變及早期癌的臨床療效分析[J].中華消化內(nèi)鏡雜志,2021,38(12):985-990.

    [3] 申玉翠,徐建華,高鵬,等.內(nèi)鏡黏膜下剝離術治療早期結直腸癌及癌前病變的回顧性分析[J].實用醫(yī)學雜志,2020,36(13):1857-1860.

    [4] 程玉,趙醒,次云哲,等.干細胞轉錄因子OCT4在結直腸癌組織中的表達及其意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2018,34(1):86-88.

    [5] 薛迪新,吳偉力,陳積賢,等.環(huán)狀RNA Cdr1as/miR-7/SP1軸調(diào)控乳腺癌細胞侵襲和轉移的研究[J].浙江醫(yī)學,2021,43(20):2162-2168.

    [6] 閆曉菲,趙廣越,喬鋆,等.miR-30c-5p及Toll樣受體4在結腸癌中的表達及意義[J].中國綜合臨床,2021,37(1):57-61.

    [7] 王德征,張爽,張輝,等.天津市結直腸癌死亡率1999—2015年變化趨勢分析[J].中華胃腸外科雜志,2019,22(6):579-586.

    [8] 鄭瑩,王澤洲.全球結直腸癌流行數(shù)據(jù)解讀[J].中華流行病學雜志,2021,42(1):149-152.

    [9] 張曉紅,南瓊.MicroRNA-7在結直腸癌中的研究進展[J].胃腸病學,2019,24(7):444-446.

    [10] 李昂,仵紅嬌,謝俞寧,等.Toll樣受體基因組特征與直腸癌臨床病理及免疫參數(shù)的相關性分析[J].解放軍醫(yī)學雜志,2021,46(4):340-347.

    基金項目:南充市市??萍紤?zhàn)略合作專項資金(20SXQT0151)

    作者簡介:何勁松(1985,12)男,碩士,四川南充人,漢族,主治醫(yī)師,研究方向:胃腸道腫瘤基礎與臨床、減重代謝性疾病的外科治療。

    通訊作者:魏壽江(1966,10)男,碩士,重慶人,漢族,教授、科室主任,研究方向:胃腸道腫瘤基礎與臨床。

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