多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)制備蒜糖醇的細(xì)胞工廠構(gòu)建及工藝優(yōu)化

趙婧邑 郭 燕 馮婷婷 陳 靜 孫欽菊 劉繼棟

(1.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院, 廣西 南寧 530004；2.廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 廣西 龍州 532415；3.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué) 食品工程系, 廣西 南寧 530007)

蒜糖醇是一種高值的六碳稀有糖醇,是多種稀有糖轉(zhuǎn)化的中間體,具有熱量低、降血壓、防便秘等特性,對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥有明顯的防治作用[1]。當(dāng)前,蒜糖醇主要從海濱錦葵中提取,然而,蒜糖醇在自然界中存在量極少,產(chǎn)物提取源受產(chǎn)地、季節(jié)、植物提取部位等因素限制,難以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求[2]。 D-葡萄糖經(jīng)化學(xué)電解還原法可以生產(chǎn)蒜糖醇,但生產(chǎn)過(guò)程會(huì)消耗大量能源,污染環(huán)境,且副產(chǎn)物多,難以推廣至工業(yè)化生產(chǎn)[3]。 相比之下,生物合成具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì),利用生物技術(shù)生產(chǎn)高值化合物已處于新興主導(dǎo)地位。

多酶級(jí)聯(lián)是指在一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中至少有2 個(gè)酶催化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行的合成策略,反應(yīng)過(guò)程中無(wú)需對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行分離,可以直接獲得目標(biāo)產(chǎn)物[4]。 基于稀有糖轉(zhuǎn)化(Izumoring)策略,Zhu 等[5]利用級(jí)聯(lián)技術(shù)建立了D-果糖轉(zhuǎn)化為蒜糖醇的細(xì)胞工廠,100 mmol/L 的果糖為底物可以產(chǎn)生10.62 g/L 的蒜糖醇。 為了進(jìn)一步降低底物成本,Wen 等[6]通過(guò)在胞外固定化葡萄糖異構(gòu)酶(glucose isomerase, GI),聯(lián)合體外酶催化和靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化,以50 g/L葡萄糖為底物生產(chǎn)得到12.7 g/L 蒜糖醇。 然而,酶的純化和固定化步驟繁瑣,催化終點(diǎn)處蒜糖醇產(chǎn)率低下,且存在中間產(chǎn)物傳遞受阻的問(wèn)題。 與之相比,利用體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)策略構(gòu)建細(xì)胞工廠使催化劑在空間位置上靠得更近,縮短了催化反應(yīng)底物傳輸?shù)穆窂?有利于提高催化效率[7]。 本研究擬通過(guò)在大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)體內(nèi)構(gòu)建多酶級(jí)聯(lián)表達(dá)系統(tǒng),創(chuàng)新性實(shí)現(xiàn)D-葡萄糖到蒜糖醇的胞內(nèi)從頭合成,并對(duì)生產(chǎn)條件以及體內(nèi)級(jí)聯(lián)催化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,旨在為低成本、規(guī)?；a(chǎn)蒜糖醇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

來(lái)源于產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providencia alcalifaciens)的核糖醇編碼基因rdh和假絲酵母(Candida boidinii)的甲酸脫氫酶編碼基因fdh,由生工生物工程(上海)股份有限公司經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成,分別連接至表達(dá)載體pET -32a( + )。 菌株E. coliDH5α、E. coliBL21(DE3),質(zhì)粒pACYCDuet -1、pETDuet-1、pRSFDuet-1,攜帶Bacillussp. (NCIM 59)gi基因的表達(dá)載體pET32a( +)-gi和攜帶Clostridium bolteae dpe基因的表達(dá)載體pET32a( +)-dpe,廣西大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保存。 PrimeSTAR、限制性核酸內(nèi)切酶,寶生物工程(大連)有限公司；無(wú)縫克隆試劑盒、DNA Marker、NAD+粉末、DNA 連接酶、SDS-PAGE 電泳試劑盒及蛋白Marker,生工生物工程(上海)股份有限公司；2 ×Rapid Taq Master Mix、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒、產(chǎn)物回收試劑盒,南京諾唯贊生物科技有限公司；D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)品、蒜糖醇標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC 1260 型高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫科技公司；JY92-IIN 細(xì)胞破碎儀,寧波新芝生物科技股份有限公司；WIX-easyPRO4 型蛋白電泳儀,北京韋克斯科技有限公司；5424R 型高速冷凍離心機(jī),美國(guó)艾本德有限公司；ZWYR-2403B 型恒溫震蕩搖床,上海智城分析儀器制造有限公司；ST3100 型精密pH 計(jì),常州奧豪斯儀器有限公司；T100 型PCR儀,上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；BMJ-160C 型霉菌培養(yǎng)箱,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大腸桿菌培養(yǎng)

LB 培養(yǎng)基配置(g/L):酵母提取物5、氯化鈉10、蛋白胨10。 調(diào)pH 值為7,121 ℃滅菌20 min 后用于E. coli的培養(yǎng)。E. coli抗性篩選時(shí),氯霉素、氨芐青霉素和卡那霉素的終質(zhì)量濃度分別為50、100、50 μg/mL。

1.3.2 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

核酸序列測(cè)定、引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成,以質(zhì)粒pET-32a( +)-gi、pET-32a( +)-dpe、pET-32a( +)-rdh和pET-32a( +)-fdh為模板,采用相應(yīng)的引物(表1)對(duì)目的基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,將目的基因依次連接至表達(dá)載體pACYCDuet-1、pETDuet-1、pET-32(a) +、pRSFDuet - 1, 以 構(gòu) 建 重 組 載 體 pAgidpe、 pEfdhrdh、32fdhlrdh和pRgidpe,并轉(zhuǎn)于克隆菌株E. coliDH5α進(jìn)行驗(yàn)證。 將驗(yàn)證正確的目的重組載體共轉(zhuǎn)于重組菌E. coliBL21(DE3),通過(guò)雙抗篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,驗(yàn)證正確即得到雙質(zhì)粒共表達(dá)重組菌。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.3.3 重組菌株蛋白表達(dá)測(cè)定

將表達(dá)菌株接種至含有相應(yīng)抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)后的菌液以1%接種量接種至裝有50 mL LB培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中,于37 ℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)2 ～3 h 至OD600為0.6 ～0.8,加入終濃度為1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG),于20 ℃、200 r/min 誘導(dǎo)24 h。收集誘導(dǎo)后的菌體,重懸后超聲破碎細(xì)胞,細(xì)胞破碎儀的工作條件為功率400 W 工作2 s,間歇3 s,總時(shí)間15 min。 將破壁后的菌體懸濁液于4 ℃、8000 r/min 條件下離心20 min,取上清液進(jìn)行SDSPAGE 鑒定。

1.3.4 酶活測(cè)定

以25 g/L D-葡萄糖、D-果糖作為催化底物,加入200 μL GI、D-阿洛酮3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase,DPEase) 粗酶液及1 mmol/L 的Co2+,40 ℃、pH 值8.0 催化10 min 后,立即沸水浴10 min終止反應(yīng)；以25 g/L D-阿洛酮糖作為催化底物,加入200 μL 核糖醇脫氫酶(ribitol dehydrogenase,RDH) 粗 酶 液、1 mmol/L 的Co2+及0.03 g/L 的NADH,40 ℃、pH 值8.0 催化10 min 后,立即沸水浴10 min 終止反應(yīng)；以100 mmol/L 甲酸鈉作為催化底物,加入200 μL 甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase,FDH)粗酶液及1 mmol/L 的NAD+,40 ℃、pH 值8.0 催化2 min 后,立即沸水浴10 min 終止反應(yīng)。 GI、DPEase、RDH 和FDH 酶活定義為單位時(shí)間內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)條件下生成1 μmol 目標(biāo)產(chǎn)物所需的酶量。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

為優(yōu)化細(xì)胞產(chǎn)酶條件,200 r/min 條件下,分別改 變 IPTG 終 濃 度(0.25、 0.50、 0.75、 1.00、1.25 mmol/L)、發(fā)酵溫度(15、20、25、30、35 ℃)和誘導(dǎo)時(shí)間(6、12、18、24、30 h)。 誘導(dǎo)結(jié)束后分別測(cè)定發(fā)酵終點(diǎn)的OD600與全細(xì)胞催化活性。

1.3.6 蒜糖醇合成條件優(yōu)化及全細(xì)胞催化活性測(cè)定

為優(yōu)化多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)催化效率,將終質(zhì)量濃度25 g/L 的葡萄糖、1 mmol/L 的Co2+、不同質(zhì)量濃度的甲酸鈉(0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 g/L)和不同終質(zhì)量濃度的全細(xì)胞(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/mL)加入至50 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖體系中,改變緩沖體系pH 值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)和反應(yīng)溫度(30、35、40、45、50 ℃),反應(yīng)30 min 后煮沸10 min 終止反應(yīng)。 葡萄糖、果糖、阿洛酮糖及蒜糖醇的檢測(cè)采用Carbomix Pb-NP 色譜柱(7.8 mm ×300 mm,10 μm)和1260 RID (G1362A)檢測(cè)器,柱溫78 ℃,流動(dòng)相為超純水,流速為0.5 mL/min,單次樣品分析采集時(shí)間為40 min[6]。 全細(xì)胞催化活性定義為1 g 干細(xì)胞單位時(shí)間內(nèi)催化合成蒜糖醇的量,將最高全細(xì)胞催化活性定義為相對(duì)酶活100%。 細(xì)胞質(zhì)量濃度(CB)按式(1)計(jì)算[8],單位g/L。

1.3.7 糖蜜預(yù)處理

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均測(cè)定3 次,采用Origin 9 處理數(shù)據(jù),Adobe Illustrator 2020 處理圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 上下游酶系表達(dá)載體與蒜糖醇細(xì)胞工廠的基礎(chǔ)構(gòu)建結(jié)果

為建立一種經(jīng)濟(jì)、綠色、高效的合成蒜糖醇的方法,實(shí)現(xiàn)葡萄糖生成蒜糖醇,分別對(duì)GI、DPEase、RDH 及FDH 4 種酶轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行驗(yàn)證。 將分別攜帶4 種酶編碼基因的BL21(DE3)/pET32a( +)系列重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后,進(jìn)行SDS-PAGE 分析和酶活測(cè)定,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。 由圖1(a)可知,泳道1 ～4 分別在Snapgene 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的相應(yīng)位置處(63.0、52.2、43.9、58.2 kDa)有明顯的條帶,分別對(duì)應(yīng)GI、DPEase、RDH 和FDH 蛋白。 以BL21(DE3)/pET32a( +)為對(duì)照菌株進(jìn)行吸光度和酶活測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。 4 種酶均顯示出相應(yīng)的催化活性,說(shuō)明已成功實(shí)現(xiàn)GI、DPEase、RDH 和FDH 在E. coliBL21(DE3)的可溶性表達(dá),且四酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)有催化葡萄糖生產(chǎn)蒜糖醇的潛力。

表2 GI、DPEase、RDH、FDH 在大腸桿菌中的酶活Tab.2 Enzymatic activities of GI, DPEase, RDH and FDH in E. coli

按照1.3.1 構(gòu)建蒜糖醇基礎(chǔ)細(xì)胞工廠BL21(DE3)/pAgidpe-pEfdhrdh,其SDS-PAGE 結(jié)果見(jiàn)圖1(b)。圖1(b)結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,泳道1 和2分別在預(yù)測(cè)結(jié)果處顯示明顯蛋白條帶(46.9、34.7、26.4、42.1 kDa),對(duì)應(yīng)GI、DPEase、RDH 及FDH 蛋白,表明四酶體系在表達(dá)宿主E. coliBL21(DE3)中同時(shí)成功表達(dá),蒜糖醇基礎(chǔ)細(xì)胞工廠構(gòu)建成功。

圖1 重組大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression products of recombinant E. coli

2.2 基礎(chǔ)細(xì)胞工廠發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

基礎(chǔ)細(xì)胞工廠發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖2。 用乳糖操縱子作為啟動(dòng)子進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)需要誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo),IPTG 是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑,在結(jié)構(gòu)上與乳糖相似,不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定[9]。 IPTG濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶水平有著顯著的影響。 由圖2(a)可知,重組菌的生物量隨著IPTG 濃度的增加而下降,當(dāng)IPTG 濃度為1.25 mmol/L 時(shí),重組菌OD600驟降至1.25,可能是由于高濃度的IPTG 對(duì)大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的毒性,抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而,隨著IPTG 濃度在0.25 ～1.00 mmol/L 升高,由于單位菌體產(chǎn)酶量逐漸增加,全細(xì)胞催化活性逐漸提升,當(dāng)IPTG 濃度為1.00 mmol/L 時(shí),催化活性達(dá)到最大值。 因此,最終確定IPTG 的優(yōu)化誘導(dǎo)濃度為1.00 mmol/L。

圖2 不同發(fā)酵條件對(duì)重組細(xì)胞生物量和催化活性的影響Fig.2 Effect of different fermentation conditions on biomass and catalytic activities of recombinant strains

誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)、質(zhì)粒穩(wěn)定性和外源蛋白合成等都有重要影響[10]。 大腸桿菌最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃,然而一方面,過(guò)高的誘導(dǎo)溫度會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成速率過(guò)快,進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)因無(wú)法正確折疊而形成無(wú)活性的包涵體,因此在對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)?？刂普T導(dǎo)溫度在35 ℃以下；另一方面,溫度過(guò)低會(huì)影響重組菌的生長(zhǎng)繁殖。 因此,確定最佳誘導(dǎo)溫度對(duì)平衡細(xì)胞產(chǎn)活性酶和重組菌的生物量至關(guān)重要。 由圖2(b)可知,當(dāng)誘導(dǎo)溫度高于25 ℃時(shí),全細(xì)胞催化活性明顯下降,可能是由于誘導(dǎo)溫度的升高導(dǎo)致胞內(nèi)包涵體蛋白量增加。 綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定20 ℃為優(yōu)化誘導(dǎo)溫度。

盡可能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最高的催化活性對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有良好的指導(dǎo)意義。 由圖2(c)可知,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),菌體量和催化活性逐漸升高,誘導(dǎo)18 h后,催化活性基本趨于穩(wěn)定,24 h 后催化活性無(wú)明顯增加,且細(xì)胞密度有所降低,可能是由于IPTG 長(zhǎng)時(shí)間在胞內(nèi)不能被菌體代謝,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用。最終確定優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間為24 h。

2.3 靜息細(xì)胞催化條件優(yōu)化結(jié)果

多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中,各個(gè)元件酶都有其最適的催化條件,協(xié)調(diào)這些催化條件才能使得整個(gè)催化系統(tǒng)發(fā)揮出整體最大的催化效率。 在多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的溫度閾值范圍內(nèi),提高溫度可以促進(jìn)級(jí)聯(lián)反應(yīng)向生成產(chǎn)物方向推進(jìn),然而超過(guò)閾值后,溫度的升高會(huì)影響蛋白酶的折疊,破壞蛋白酶大分子的三維結(jié)構(gòu),導(dǎo)致酶失去活性[11]。 全細(xì)胞催化條件優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3(a)可知,全細(xì)胞催化活性隨溫度升高而逐漸增加,當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)達(dá)到最大值；隨著溫度繼續(xù)升高,活性顯著下降,當(dāng)催化溫度為50 ℃時(shí),催化活性只有最大值的51.94%。 因此,確定40 ℃為優(yōu)化催化溫度。

pH 值通過(guò)影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型、穩(wěn)定性以及底物的解離狀態(tài)影響多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的催化效率[12]。由圖3(b)可知,pH 值7.0 ～9.0 時(shí),當(dāng)pH 值小于8.0 時(shí),催化活性隨著pH 值的增加而升高；在pH值為8.0 時(shí),催化活性達(dá)到最大；然而當(dāng)pH 值繼續(xù)升高時(shí),活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì),證明過(guò)低或過(guò)高的pH值均不利于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行。 因此,合成蒜糖醇的優(yōu)化pH 值為8.0。

2018 International training workshop on environment friendly and safety of household care chemical products convered 10 59

在單位體積內(nèi),全細(xì)胞催化活性與菌體質(zhì)量濃度成正比,然而,轉(zhuǎn)化效率不會(huì)隨著菌體質(zhì)量濃度的增加而持續(xù)增加,為平衡經(jīng)濟(jì)性與高效性,需確定最高轉(zhuǎn)化效率時(shí)的菌體質(zhì)量濃度。 由圖3(c)可知,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度固定為25 g/L,催化體系中細(xì)胞質(zhì)量濃度在0.01 ～0.05 g/mL 時(shí),催化活性隨菌體質(zhì)量濃度的增加而顯著提高；隨著菌體質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加,催化活性趨于穩(wěn)定。 最終確定在25 g/L 的底物條件下,催化體系中優(yōu)化菌體質(zhì)量濃度為0.05 g/mL。

在多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中,甲酸鈉作為輔底物參與了下游酶系中的氧化還原反應(yīng)模塊,因此甲酸鈉的質(zhì)量濃度對(duì)蒜糖醇的生成率也有一定的影響,因此探究了甲酸鈉添加量對(duì)全細(xì)胞催化活性的影響。 由圖3(d)可知,除輔底物終質(zhì)量濃度為1.0 g/L 外,全細(xì)胞催化活性隨甲酸鈉質(zhì)量濃度的增加而提升；當(dāng)甲酸鈉的質(zhì)量濃度為5.0 g/L 時(shí),全細(xì)胞催化活性最高；繼續(xù)提高甲酸鈉質(zhì)量濃度,催化活性無(wú)明顯變化。 因此,確定甲酸鈉的優(yōu)化質(zhì)量濃度為5.0 g/L。

采用優(yōu)化催化條件對(duì)基礎(chǔ)細(xì)胞工廠BL21(DE3)/pAgidpe-pEfdhrdh的轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)圖4。 0 ～12 h 內(nèi),催化體系內(nèi)蒜糖醇產(chǎn)量明顯增多；12 ～15 h,體系內(nèi)蒜糖醇的合成速率下降,蒜糖醇產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。 在催化終點(diǎn)處,體系內(nèi)剩余4.95 g/L 葡萄糖,轉(zhuǎn)化率為80.20%,并有19.33 g/L蒜糖醇生成,產(chǎn)率達(dá)77.32%。 因此,本研究構(gòu)建的多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)能夠正常催化D-葡萄糖合成蒜糖醇。然而,反應(yīng)過(guò)程仍存在細(xì)胞催化活性低,反應(yīng)前期中間產(chǎn)物有大量積累的問(wèn)題,且催化終點(diǎn)處仍有底物D-葡萄糖未被轉(zhuǎn)化。 因此需要進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)體系,從而提高全細(xì)胞多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的催化效率。

圖4 BL21(DE3)/pAgidpe-pEfdhrdh 催化D-葡萄糖生成蒜糖醇Fig.4 Biosynthesis of allitol from D-glucose by BL21(DE3)/pAgidpe-pEfdhrdh

2.4 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 上游基因質(zhì)粒拷貝數(shù)提升結(jié)果

大腸桿菌雙表達(dá)框質(zhì)粒pACYCDuet -1、pETDuet-1 和pRSFDuet-1 的基因拷貝數(shù)分別為10、40和100[13]。 為提升底物的轉(zhuǎn)化率,需提高上游酶系的表達(dá)量。 本研究選擇了高拷貝載體pRSFDuet-1作為表達(dá)載體骨架進(jìn)行上游酶系的構(gòu)建。 將重組質(zhì)粒pRgidpe和pEfdhrdh共轉(zhuǎn)化于表達(dá)菌株E. coliBL21(DE3),經(jīng)Kan 與Amp 雙抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,得到蒜糖醇細(xì)胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-pEfdhrdh,構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖5(a)。 細(xì)胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-pEfdhrdh的SDS-PAGE 結(jié)果見(jiàn)圖5(b)。由圖5(b)可知,與對(duì)照組相比,泳道3 在46.9、34.7、26.4、42.1 kDa 處顯示明顯的蛋白條帶,分別與GI、DPEase、RDH 和FDH 蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果大小一致,表明四酶體系在表達(dá)宿主E. coliBL21(DE3)中同時(shí)成功表達(dá)。

圖5 細(xì)胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-pEfdhrdh 構(gòu)建示意圖和SDS-PAGE 分析Fig.5 Schematics and SDS-PAGE analysis of cell factory BL21(DE3)/pRgidpe-pEfdhrdh

2.4.2 下游酶系的融合表達(dá)結(jié)果

蛋白質(zhì)融合可以在多酶活性中心位點(diǎn)間形成底物通 道, 甘 氨酸 G 和 絲 氨 酸 S 的 GS 組 合(GGGGS)n可以通過(guò)改變n的大小實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域之間距離的放大和減小[14]。 為減少中間產(chǎn)物的積累,將輔酶循環(huán)系統(tǒng)中的RDH 和FDH 通過(guò)柔性linker(GGGGS)3進(jìn)行連接,在縮短兩蛋白質(zhì)空間距離的同時(shí),實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域的分離,保證RDH 和FDH 的單獨(dú)活性,構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖6(a)。 將重組質(zhì)粒pRgidpe與32fdhlrdh共轉(zhuǎn)化于表達(dá)菌株E. coliBL21(DE3),經(jīng)Kan 與Amp 雙抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,得到蒜糖醇細(xì)胞工廠 BL21 (DE3)/ pRgidpe-32fdhlrdh,其SDS - PAGE 結(jié)果見(jiàn)圖6 (b)。 由圖6(b)可知,與對(duì)照組相比,泳道6 在預(yù)測(cè)結(jié)果46.9、34.7、85.1 kDa 處顯示明顯的蛋白質(zhì)條帶,表明多酶體系在表達(dá)宿主E. coliBL21(DE3)中同時(shí)成功表達(dá)。

圖6 細(xì)胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-32fdhlrdh構(gòu)建示意圖和SDS-PAGE 分析Fig.6 Schematics and SDS-PAGE analysis of cell factory BL21(DE3)/pRgidpe-32fdhlrdh

2.5 重組大腸桿菌全細(xì)胞合成蒜糖醇結(jié)果

在優(yōu)化催化條件下,分別對(duì)BL21 (DE3)/pRgidpe- pEfdhrdh和 BL21 ( DE3)/pRgidpe-32fdhlrdh多酶級(jí)聯(lián)催化系統(tǒng)的反應(yīng)特性進(jìn)行研究,反應(yīng)進(jìn)程產(chǎn)物變化見(jiàn)圖7。 由圖7(a)可知,與基礎(chǔ)細(xì)胞工廠BL21(DE3)/pAgidpe-pEfdhrdh相比,在相同的反應(yīng)條件下,0.05 g/mL 細(xì)胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-pEfdhrdh對(duì)底物D-葡萄糖的利用率有所提升,催化終點(diǎn)葡萄糖的殘?zhí)橇拷抵?.05 g/L,蒜糖醇的產(chǎn)量達(dá)到20.27 g/L,然而在反應(yīng)前期中間產(chǎn)物仍有明顯積累。 由圖7(b)可知,進(jìn)一步融合表達(dá)下游酶系后,0.05 g/mL 細(xì)胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-32fdhlrdh催化進(jìn)程顯示,反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)的時(shí)間由12 h 縮短至9 h。 反應(yīng)前期中間產(chǎn)物的質(zhì)量濃度明顯降低,反應(yīng)終點(diǎn)處D-葡萄糖殘留量進(jìn)一步下降至3.70 g/L,蒜糖醇的產(chǎn)量達(dá)到21.12 g/L。 相較于Wen 等[6]的研究,本研究利用更低質(zhì)量濃度的葡萄糖(25 g/L)為底物,以全細(xì)胞為催化劑,將蒜糖醇的產(chǎn)量提升了66.28%。

圖7 不同細(xì)胞工廠催化D-葡萄糖生物合成蒜糖醇Fig.7 Biosynthesis of allitol from D-glucose by different cell factories

廢糖蜜是制糖過(guò)程中在進(jìn)行末端糖膏分離時(shí)的主要副產(chǎn)物,價(jià)格低廉,含有豐富的糖類物質(zhì),現(xiàn)已作為一種廉價(jià)碳源被廣泛用于發(fā)酵行業(yè)。 微波硫酸法可以有效地將糖蜜中的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。 預(yù)處理后的糖蜜樣品中含有(1.17 ±0.63) g/L蔗糖、(116.97 ± 0.29) g/L 葡萄糖和(110.10 ±1.37) g/L 果糖。 為探究pRgidpe-32fdhlrdh菌株的工業(yè)適用性,在優(yōu)化條件下,取220 μL 糖蜜樣品作為唯一碳源進(jìn)行催化實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖8。 由圖8 可知,催化終點(diǎn)處生成37.62 g/L 蒜糖醇,證明pRgidpe-32fdhlrdh是利用糖蜜生產(chǎn)蒜糖醇的潛力菌株。

圖8 葡萄糖和蒜糖醇HPLC 檢測(cè)結(jié)果Fig.8 HPLC detection results of glucose and allitol

3 討 論

隨著稀有糖的需求量不斷提升,開(kāi)發(fā)一種高效、廉價(jià)的蒜糖醇生產(chǎn)方法已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。與以純酶或粗酶參與的體外級(jí)聯(lián)方式相比,體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)采用全細(xì)胞方式催化整個(gè)反應(yīng),無(wú)需復(fù)雜的蛋白質(zhì)純化步驟[15]。 同時(shí),由于微生物可以將酶與惡劣的外環(huán)境隔離,使酶在內(nèi)環(huán)境中保持更穩(wěn)定的催化活力[16]。 構(gòu)建完成的細(xì)胞工廠可以通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)快速大量獲得,對(duì)于多酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的工業(yè)規(guī)?；瘧?yīng)用具有重要的意義。 本研究構(gòu)建了攜帶GI、DPEase、RDH 和FDH 編碼基因的重組大腸桿菌,成功實(shí)現(xiàn)以葡萄糖為底物合成蒜糖醇。 然而,在優(yōu)化反應(yīng)條件下,仍存在細(xì)胞催化活性低,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題。

外源基因的表達(dá)量通常隨質(zhì)?？截悢?shù)的增加而提高,因此,質(zhì)?？截悢?shù)的變化影響了目標(biāo)產(chǎn)物的得率[17]。 有研究使用高拷貝質(zhì)粒使得目標(biāo)酶在微生物宿主中充分表達(dá),然而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),由于所表達(dá)蛋白質(zhì)的性質(zhì)差異,工程菌所攜帶的質(zhì)?？截悢?shù)與蛋白質(zhì)表達(dá)量不一定成比例關(guān)系,高拷貝質(zhì)粒會(huì)增加細(xì)胞的代謝壓力,且導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊[18-19]。 因此,進(jìn)一步了解質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)蒜糖醇合成酶系的影響,對(duì)于提高葡萄糖的利用率,進(jìn)而增加目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率是十分必要的。 本研究結(jié)果表明:質(zhì)?？截悢?shù)的提高使得葡萄糖轉(zhuǎn)化率升高,即使用高拷貝數(shù)質(zhì)粒有效提高了上游酶系的胞內(nèi)表達(dá)量,該結(jié)果與何成等[20]的研究結(jié)果相似。

在多酶級(jí)聯(lián)催化系統(tǒng)中,縮短蛋白酶之間的距離可以促進(jìn)中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn),減少中間產(chǎn)物的積累[21]。 通過(guò)基因融合引入linker 連接肽將多酶組裝形成復(fù)合體,可以拉近蛋白酶活性中心之間的空間距離,形成相應(yīng)的底物通道,是一種高效、經(jīng)濟(jì)的提高多酶催化效率和輔因子再回收的組裝策略[22]。 Jeon 等[23]將乙醇脫氫酶(ADH)和單加氧酶(BVMOs)進(jìn)行融合,構(gòu)建了從長(zhǎng)鏈仲醇到酯的大腸桿菌轉(zhuǎn)化平臺(tái),相較于游離表達(dá)2 個(gè)酶,融合蛋白ADH-Gly-BVMO 的表達(dá)使細(xì)胞催化效率提高了40%。 然而也有研究表明,不同組分和長(zhǎng)度的連接肽可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)在胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊,使其催化活力損失[24]。 本研究結(jié)果表明:融合酶維持了結(jié)構(gòu)域靈活性和2 個(gè)親代酶功能的特性,有效促進(jìn)了中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)和輔因子的循環(huán),進(jìn)而解決了反應(yīng)前期中間產(chǎn)物大量積累的問(wèn)題,縮短了反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間。

4 結(jié)論

本研究以大腸桿菌為底盤細(xì)胞,利用GI、DPEase 和RDH 催化葡萄糖生成蒜糖醇,并偶聯(lián)FDH 進(jìn)行輔酶再生,成功實(shí)現(xiàn)了利用微生物細(xì)胞工廠以廉價(jià)底物合成高值化合物蒜糖醇的目的。通過(guò)上游酶系拷貝數(shù)的提升與下游酶系的融合表達(dá),在促進(jìn)了葡萄糖轉(zhuǎn)化的同時(shí),也減少了反應(yīng)前期中間產(chǎn)物的積累,縮短了反應(yīng)達(dá)到催化終點(diǎn)的時(shí)間,進(jìn)一步提升了蒜糖醇的產(chǎn)量與全細(xì)胞催化活性。 本研究旨在為蒜糖醇的工業(yè)生產(chǎn)建立一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)友好型的生物合成方法,為有效提高制糖工業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和廢糖蜜的進(jìn)一步綜合利用提供途徑。