產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選鑒定及響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝

秦 昊 劉 凱 鄧文璽 李 珊 于淑萍 王夢(mèng)圓 郭東會(huì)

（山東第一醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271016）

脂肪酶在人們的生產(chǎn)生活中發(fā)揮著重要作用[1]。脂肪酶可以提高一些食品添加劑的脂溶性，如抗壞血酸，從而可以使其更好地應(yīng)用于脂類食品中[2-3]；在藥物生產(chǎn)中，脂肪酶催化拆分手性藥物[3]；在白酒生產(chǎn)中可以通過脂肪酶催化形成酯類化合物以增添白酒的風(fēng)味[4]；在制革行業(yè)中需要進(jìn)行脫脂、脫毛等操作，這些操作耗時(shí)耗力、人工成本高，若使用脂肪酶可以加快生產(chǎn)速度、減少成本[1]。

脂肪酶來源豐富，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。其中細(xì)菌、真菌和酵母產(chǎn)生的脂肪酶活力很高，而且微生物繁殖迅速，因而具有比動(dòng)植物源脂肪酶更廣泛的作用pH值和溫度范圍[5-6]。與動(dòng)植物源脂肪酶相比，微生物產(chǎn)生的脂肪酶成本較低、更易分離純化、生產(chǎn)較為方便等，因而更具有研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料。本試驗(yàn)土樣取自山東第一醫(yī)科大學(xué)后廚以及泰安油坊富含油脂的土壤，將采集的樣品裝入樣品袋中保存并做好標(biāo)簽。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑。富集培養(yǎng)基[7]成分為：酵母浸粉0.2g/L、NaCl 0.5 g/L、Na2HPO43.5 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

篩選培養(yǎng)基[7]：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、K2HPO40.5 g/L，pH值7.2～7.4。固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂，在121℃條件下滅菌20 min。初篩培養(yǎng)基中加入羅丹明B 10 mL/L、橄欖油乳化液12 mL/L。復(fù)篩培養(yǎng)基中加入橄欖油乳化液12 mL/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基[7]：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.1 g/L、橄欖油乳化液12 mL/L，pH值6。

種子培養(yǎng)基[8]：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨25 g/L、K2HPO45 g/L、（NH4）2SO45 g/L、MgSO40.5 g/L、橄欖油乳化液10 mL/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的富集培養(yǎng)。取10 g土樣溶于90 mL無菌水中制成土壤懸液[9]，以1%接種量接入富集培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。連續(xù)重復(fù)培養(yǎng)3 代。 富集培養(yǎng)液按稀釋倍數(shù)為 10-4、10-5、10-6、10-7進(jìn)行濃度梯度稀釋，取0.1 mL均勻涂布在篩選培養(yǎng)基上，于 28 ℃倒置培養(yǎng) 2～4 d[7，10]。

1.2.2 目標(biāo)菌株篩選。選取在360 nm紫外光下菌落周圍熒光圈較大的單菌落[11]，并對(duì)其劃線分離，直到平板中只存在一種菌落。將分離純化的菌株接入斜面培養(yǎng)基中，保存于含甘油30%的管中，放入4℃冰箱中保存。

1.2.3 菌種鑒定。將脂肪酶含量最高的菌株Youzh-1送去北京睿博興生物技術(shù)有限科公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析，并進(jìn)行同源性對(duì)比分析，利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 酶活測(cè)定方法。參照文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行脂肪酶活力測(cè)定，并略作修改。

1.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗(yàn)。通過單因素試驗(yàn)考察培養(yǎng)基中碳源（葡萄糖、NaHCO3、蛋白胨、蔗糖、乳糖）、氮源（硫酸銨、硝酸鈉、尿素、酵母膏、牛肉膏）、溫度（28、30、34、37、40 ℃）、pH 值（5、6、7、8、9）對(duì)脂肪酶活性的影響，以確定最適產(chǎn)酶條件。

1.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取4個(gè)相關(guān)影響因素，并以酶活力作為因變量，利用Design Expert 11.0軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)（4因素3水平），以探究高產(chǎn)脂肪酶菌株的最佳發(fā)酵工藝和參數(shù)組合并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。試驗(yàn)因素和水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酶菌株的篩選

從土壤中得到多種菌株，在經(jīng)過平板初篩及酶活測(cè)定復(fù)篩之后從中選出具有高產(chǎn)脂肪酶性質(zhì)的菌株。得到的一株高產(chǎn)脂肪酶菌株為Youzh-1，脂肪酶活力為37.67 U/mL。

2.2 菌種鑒定

選脂肪酶活力最高的菌株Youzh-1經(jīng)16S rRNA測(cè)序分析后，再通過NCBI中的BLAST同源性對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中，Youzh-1與Pseudomonas fluorescens菌株ORTB3的16S rRNA同源性為100%。利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹，Youzh-1與熒光假單胞菌親緣關(guān)系最近，可以確定Youzh-1為熒光假單胞菌屬（圖1）。

2.3 單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

2.3.1 碳源種類以及碳源添加量對(duì)脂肪酶活力的影響。由圖2和圖3可知，在以碳源為葡萄糖時(shí)脂肪酶的活力最高，碳源為NaHCO3時(shí)脂肪酶活力最低，故最適碳源為葡萄糖。當(dāng)葡萄糖添加量為5～15 g/L時(shí)，脂肪酶活力不斷增大并在葡萄糖添加量為15 g/L時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)葡萄糖添加量為15～25 g/L時(shí)，脂肪酶活力不斷降低。因此，最適葡萄糖添加量為15 g/L。

2.3.2 溫度對(duì)脂肪酶活力的影響。從圖4可以看出，當(dāng)菌株Youzh-1發(fā)酵溫度在28～31℃時(shí)，脂肪酶活力突然增大；在31～37℃時(shí)脂肪酶活力呈不穩(wěn)定上升趨勢(shì)，并在37℃時(shí)達(dá)到最大；在37～40℃酶活迅速下降。因此，對(duì)于Youzh-1菌株來說，菌株最適發(fā)酵溫度為37℃。

2.3.3 pH值對(duì)脂肪酶活力的影響。從圖5可以看出，菌株Youzh-1產(chǎn)生的脂肪酶活力在pH值5～6范圍內(nèi)不斷上升，并在pH值為6時(shí)達(dá)到最大值，在pH值6～9范圍內(nèi)迅速下降，可見pH值對(duì)于脂肪酶活力的影響較大。

2.3.4 氮源種類以及氮源添加量對(duì)脂肪酶活力的影響。由圖6和圖7可知，當(dāng)?shù)礊榕Ｈ飧鄷r(shí)，脂肪酶的活力最高，當(dāng)?shù)礊槟蛩貢r(shí)，脂肪酶活力最低，故最適氮源為牛肉膏。當(dāng)牛肉膏添加量為5～15 g/L時(shí)，脂肪酶活力變化不明顯；牛肉膏添加量為15～20 g/L時(shí)，脂肪酶活力急劇升高并在20 g/L時(shí)達(dá)到最高；當(dāng)牛肉膏添加量大于20 g/L時(shí)脂肪酶活力下降。由此可以看出，牛肉膏添加量為20 g/L時(shí)對(duì)菌株Youzh-1發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶最有利。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。利用Design Expert 11.0軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)各因素的響應(yīng)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化高產(chǎn)脂肪酶菌株發(fā)酵工藝試驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert 11.0對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到以酶活大小作為響應(yīng)值的回歸方程為：Y=85.06+6.70A+7.40B+2.97C+0.6337D-6.40AB-1.97AC-1.53AD+0.3025BC+1.01BD-3.09CD-8.91A2-0.67B2-11.87C2-10.45D2。

2.4.2 回歸模型方差分析。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，如表3所示。模型的P值＜0.000 1，表明本試驗(yàn)選用的二次多項(xiàng)模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.301 3＞0.05，不顯著，表明模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度好，誤差小；相關(guān)系數(shù)R2=0.932 6，表明了試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的擬合性較好，能夠較真實(shí)地模擬曲面；模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.865 2，表明該模型可以解釋86.52%的變化。從方差分析結(jié)果可以看出，4個(gè)因素對(duì)脂肪酶活性的影響作用從大到小依次為B＞A＞C＞D。

表3 高產(chǎn)脂肪酶菌株發(fā)酵條件回歸模型方差分析

2.4.3 發(fā)酵條件各因素相互作用分析。從圖8可以看出，隨著葡萄糖和牛肉膏的增加脂肪酶活力呈先增大后減少的趨勢(shì)，而且從其等高線圖中可以看出，葡萄糖添加量一側(cè)的等高線較陡，說明葡萄糖添加量對(duì)脂肪酶活力影響較牛肉膏添加量對(duì)脂肪酶活力的影響更明顯；隨著葡萄糖添加量和溫度增加脂肪酶活力呈先增大后減少的趨勢(shì)，而且從其等高線圖中可以看出，葡萄糖添加量一側(cè)的等高線較陡，說明葡萄糖添加量對(duì)脂肪酶活力影響較溫度對(duì)脂肪酶活力的影響更明顯；隨著牛肉膏添加量和溫度增加，脂肪酶活力呈先增大后減小的趨勢(shì)，而在其等高線圖中可以看出，牛肉膏添加量與溫度的等高線圖近似于圓形，說明牛肉膏添加量與溫度對(duì)于脂肪酶活力的交互作用不太明顯；隨著牛肉膏添加量和pH值的增加，脂肪酶活力呈先增大后減小的趨勢(shì)，從其等高線圖中可以看出，二者的等高線圖近似于圓形，說明二者對(duì)于脂肪酶活力的交互作用不明顯；隨著葡萄糖添加量和pH值增加，脂肪酶活力呈先增大后減少的趨勢(shì)，而且從其等高線圖可以看出，葡萄糖添加量一側(cè)的等高線較陡，說明葡萄糖添加量對(duì)脂肪酶活力影響較pH值對(duì)脂肪酶活力的影響更明顯；隨著溫度和pH值的增加，脂肪酶活力呈先增大后減小的趨勢(shì)，而且從其等高線圖可以看出，pH值一側(cè)的等高線相對(duì)于溫度一側(cè)較為密集，說明pH值較溫度對(duì)脂肪酶活力的影響明顯。

2.4.4 發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。在模型預(yù)測(cè)的培養(yǎng)基最優(yōu)配比條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，預(yù)測(cè)的脂肪酶活力理論最大值達(dá)到87.19 U/mL。通過響應(yīng)面法得到優(yōu)化后的發(fā)酵條件為葡萄糖添加量18.825 g/L、牛肉膏添加量25.98 g/L、溫度41℃、pH值6，在此條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證，測(cè)定脂肪酶活力為79.87 U/mL，較模型預(yù)測(cè)理論值87.19 U/mL減少了8.39%，證明模型可靠。

3 結(jié)論與討論

脂肪酶作為生產(chǎn)生活中重要的酶之一，現(xiàn)已有越來越多的研究者對(duì)其進(jìn)行多方面的研究。將菌株用于工業(yè)生產(chǎn)，都必須先對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[14]。因此，在工業(yè)上通過優(yōu)化發(fā)酵工藝提高酶產(chǎn)量來壓縮生產(chǎn)成本有著重要意義[15]。

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)熒光假單胞菌的發(fā)酵條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到最佳發(fā)酵工藝為葡萄糖添加量18.825 g/L、牛肉膏添加量25.98 g/L、溫度41℃、pH值6，在此條件下測(cè)得脂肪酶活力為79.87 U/mL，較理論值87.19 U/mL減少了8.39%，證明模型可靠。微生物來源的脂肪酶具有易生產(chǎn)、易于分離純化、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，可以在工業(yè)生產(chǎn)中利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶，下一步可就菌株遺傳改良進(jìn)行研究，以提高脂肪酶活力。