短葶山麥冬莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)與植株再生

袁玉虹，董 雯，孫 艷，何天友，鄭郁善cc

(1.福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 南平 353000；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福建 福州 350002)

1 引言

短葶山麥冬(Liriopemuscari(Decn.)Bailey)收錄在2015年版的《中華人民共和國藥典》山麥冬名下[1]，為百合科山麥冬屬多年生草本植物，又名福建麥冬，主要分布在福建泉州低海拔地區(qū)，我國江蘇、安徽、浙江及廣西等省區(qū)均有分布[2]。短葶山麥冬是集藥用、食用、保健及觀賞于一身的園藝植物[3]，其藥用部位為干燥塊根，主要具有養(yǎng)陰生津，潤肺清心功效，在臨床上治療腫瘤、肺結(jié)核、便秘、失眠等疾病。

以山麥冬為原料各類保健飲品、藥品不斷被研制出來，麥冬的市場需求量上升趨勢(shì)明顯，而短葶山麥冬是國內(nèi)主流商品麥冬類藥材，有效成分含量并不低于川麥冬，具有巨大的市場開發(fā)潛力。目前短葶山麥冬以播種繁殖和分蘗繁殖為主[3]，播種繁殖成苗時(shí)間長，出苗率低、性狀不穩(wěn)定、易受季節(jié)限制等問題；分蘗繁殖效率慢、繁殖率低、性狀易退化等風(fēng)險(xiǎn)，這兩種方式均不利于短葶山麥冬作為工廠化生產(chǎn)種植的首選。組織培養(yǎng)可在不受外界環(huán)境條件的限制下實(shí)現(xiàn)快速大量繁殖種苗，且能較好地保持母本的優(yōu)良性狀[4]，是實(shí)現(xiàn)短葶山麥冬工廠化育苗及良種推廣應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)。

目前國內(nèi)關(guān)于麥冬的組織培養(yǎng)激素配比研究較多[5～8]，但不同的研究人員選用的激素種類、用量和組合不一樣，研究的結(jié)果也不盡相同。因此，本研究采用L9(34)正交試驗(yàn)研究激素類型和濃度對(duì)短葶山麥冬愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以提高其愈傷組織誘導(dǎo)率及其品質(zhì)，為改良短葶山麥冬工廠化生產(chǎn)提供一定依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 試驗(yàn)材料

選用從泉州洛江區(qū)短葶山麥冬GAP基地移栽至福建農(nóng)林大學(xué)福建省中藥材GAP工程技術(shù)研究中心苗圃的優(yōu)良短葶山麥冬。

2.2 材料處理

選用長勢(shì)較好的短葶山麥冬植株莖尖，用肥皂水浸泡15 min去除植株表面附著物，然后將植株莖尖置于流水沖洗1 h后轉(zhuǎn)置超凈工作臺(tái)，用滅菌水沖洗3遍，用75%乙醇溶液消毒30 s后再用滅菌水沖洗3遍，然后置于0.1%升汞消毒劑中浸泡10 min，用滅菌水沖洗3遍。將消毒后的短葶山麥冬莖尖切取長度為5 mm的小段為外植體以備用。

2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

將滅菌的外植體接種在以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同植物生長調(diào)劑誘導(dǎo)愈傷組織。激素濃度配比采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，以2，4-D、6-BA、NAA 3個(gè)因子。其中培養(yǎng)基中瓊脂7 g/L，蔗糖濃度為30 g/L，pH值調(diào)至5.8。每個(gè)處理接種外植體30瓶，每瓶一個(gè)外植體，3次重復(fù)，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長情況及誘導(dǎo)率。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4 愈傷組織繼代培養(yǎng)

選取生長狀況較好的愈傷組織接種在以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同植物生長調(diào)劑進(jìn)行繼代培養(yǎng)。激素濃度配比采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)，以2，4-D、6-BA、NAA 3個(gè)因子。其中瓊脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8。每次20瓶，每瓶接種愈傷組織重量為0.2 g，45 d后統(tǒng)計(jì)出愈傷組織培養(yǎng)過程中的增殖系數(shù)。

表2 愈傷組織繼代培養(yǎng)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5 不定芽誘導(dǎo)

選取生長狀況較好的愈傷組織接種在以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA+NAA 0.5 mg/L激素組合進(jìn)行對(duì)不定芽誘導(dǎo),6-BA濃度配比如表3。其中瓊脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8。每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種2～3個(gè)愈傷組織，3次重復(fù)，45 d后統(tǒng)計(jì)分化情況并計(jì)算誘導(dǎo)率。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

短葶山麥冬外植體接種后，第9 d后開始長出愈傷，30 d后統(tǒng)計(jì)各處理的出愈率及愈傷生長狀況。由表4可見，激素配比組合5出愈率優(yōu)勢(shì)明顯，達(dá)94.55%，且愈傷組織質(zhì)量最佳(圖1)，其次是組合7，出愈率81.13%，愈傷組織質(zhì)量中上。從表5方差分析看出，NAA和2,4-D對(duì)短葶山麥冬莖尖愈傷組織秀導(dǎo)率存在顯著影響。由極差分析結(jié)果表明，影響短葶山麥冬莖尖愈傷組織因素的激素主次順次為：2.4-D>NAA>6-BA，就出愈率而言最優(yōu)組合為A2B1C3，即激素配比2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織效果最佳。同時(shí)，從圖2可以得知，在一定范圍內(nèi)，隨著2,4-D和NAA濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率呈先上升后下降的趨勢(shì)，可能高濃度的植物激素會(huì)抑制愈傷組織的形成；隨6-BA濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率呈逐漸遞減的趨勢(shì)。

表3 不定芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4 不同激素配比對(duì)短葶山麥冬莖尖愈傷誘導(dǎo)率極差分析

表5 不同激素配比對(duì)短葶山麥冬莖尖愈傷誘導(dǎo)率方差分析

圖1 組合5愈傷組織誘導(dǎo)

3.2 不同激素配比對(duì)繼代增殖的影響

從表6可以看出，短葶山麥冬愈傷繼代增殖系數(shù)最高的處理為組合6，即1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA，增殖系數(shù)達(dá)到5.1，與組合5相比增殖系數(shù)差異不明顯顯著高于其他激素配比組合。從表7方差分析看出，2.4-D濃度和6-BA濃度對(duì)對(duì)短葶山麥冬愈傷組織繼代增殖系數(shù)的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)，由極差分析結(jié)果顯示，影響愈傷組織繼代增殖系數(shù)因素的激素主次順次為：2.4-D>6-BA>NAA，就增殖系數(shù)而言最優(yōu)組合為A2B3C2，即激素配比1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA的MS培養(yǎng)基愈傷組織繼代培養(yǎng)效果最佳。2,4-D和6-BA濃度在一定范圍內(nèi)，愈傷組織的增殖系數(shù)隨濃度的升高呈先上升后降低的趨勢(shì)，說明激素濃度過高或過低都不適合愈傷組織的繼代培養(yǎng)。NAA濃度在0～0.1 mg/L之間愈傷組織增殖系數(shù)無顯著變化。

圖2 不同激素因素水平與短葶山麥冬愈傷誘導(dǎo)率關(guān)系趨勢(shì)

表6 不同激素配比對(duì)愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)極差分析

表7 不同激素配比對(duì)愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)方差分析

3.3 不同6-BA濃度對(duì)愈傷組織不定芽分化的影響

由表8可知，不同濃度6-BA對(duì)短葶山麥冬愈傷組織再生的影響存在著明顯差異。出芽效果最好的為組合7，即6-BA濃度為4.0 mg/L時(shí)，短葶山麥冬愈傷組織不定芽增殖系數(shù)達(dá)到5.54，分化出叢生芽，苗高且葉粗(圖3)。6-BA濃度在1～8 mg/L范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織的分化呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖4)。

表8 不同濃度6-BA對(duì)愈傷不定芽分化的影響

圖3 組合7不定芽分化狀況

圖4 不同濃度6-BA對(duì)不定芽分化的趨勢(shì)

4 結(jié)論與討論

植物激素是影響植物組織培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵因素[9]。在組織培養(yǎng)中基本培養(yǎng)基MS僅能保證外植體存活，要獲得優(yōu)質(zhì)的試管苗必須在基本培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑。不同植物生長調(diào)劑的不同濃度配比對(duì)外植體生長和分化作用不同，如生長素類主要是誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織和促進(jìn)不定根的發(fā)生，細(xì)胞分裂素類常用來誘導(dǎo)不定芽的形成。

以短葶山麥冬莖尖為外植體，在愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)階段選用不同濃度配比2,4-D、NAA和6-BA。本試驗(yàn)結(jié)果顯示愈傷組織誘導(dǎo)率最佳的激素配比為：2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/LNAA，出愈率達(dá)到94.55%，愈傷組織質(zhì)地緊密，生長旺盛，質(zhì)量最優(yōu)。相關(guān)研究表明，2,4-D和NAA可顯著誘導(dǎo)愈傷組織形成[10～12]，與本研究結(jié)論一致。其中，2,4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響最大，且濃度在0～2 mg/L范圍內(nèi)，與愈傷組織生長呈正相關(guān)。

從愈傷組織中大量快速增殖是工廠化育苗快速繁殖一個(gè)重要途徑[13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將2,4-D濃度降低至1.0 mg/L，激素配比為1.0mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA的繼代培養(yǎng)基上，短葶山麥冬愈傷組織凈增鮮重為1.08g，增殖系數(shù)達(dá)到5.1。萬學(xué)鋒[14，15]研究發(fā)現(xiàn)短葶山麥冬莖尖誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織比較致密，不能滿足繼代增殖需要，必須改變培養(yǎng)基中激素配比，降低2,4-D的濃度能使愈傷組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，與其研究結(jié)論一致。前人研究發(fā)現(xiàn)植株再生培養(yǎng)中6-BA對(duì)芽增殖起重要作用，且與低濃度的生長素配比可更有利于不定芽的形成[16，17]。在MS培養(yǎng)基中添加4 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA，不定芽增殖系數(shù)達(dá)到5.54，分化出叢生芽，苗高且葉粗，效果最佳，且當(dāng)NAA濃度相同時(shí)，6-BA濃度在0～4 mg/L范圍內(nèi)，與不定芽的形成呈正相關(guān)。