吡啶-2,6-二羧酸處理對(duì)梨果采后黑斑病控制作用及其抑菌機(jī)理

楊陽(yáng)陽(yáng)，劉志恬，李永才*，畢 陽(yáng)，盧玉慧，謝鵬東

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

早酥梨是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所將蘋(píng)果與梨進(jìn)行雜交得到的一種新的梨品種，該品種皮薄肉多、果肉白細(xì)、酥脆爽口、汁多味甜，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)12.1%～15.1%，可食用率高達(dá)95%。除此以外，該品種連續(xù)結(jié)果能力強(qiáng)，豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，所以成為眾多梨品種當(dāng)中的最佳栽培對(duì)象之一。早酥梨的采收期為每年的7ü8月，氣溫較高，這對(duì)后續(xù)早酥梨的銷(xiāo)售非常不利。微生物侵染會(huì)嚴(yán)重影響早酥梨的品質(zhì)，商業(yè)價(jià)值迅速降低，給果農(nóng)造成經(jīng)濟(jì)損失。其中由互隔交鏈孢（）引起的黑斑病是早酥梨采后主要的病害之一，在室溫環(huán)境下會(huì)快速生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生毒素，不僅會(huì)使果實(shí)腐敗，還會(huì)對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康造成潛在安全風(fēng)險(xiǎn)。目前常用人工合成化學(xué)殺菌劑控制梨果采后病害，但因長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑會(huì)產(chǎn)生農(nóng)用殘留、造成環(huán)境污染，也會(huì)使病原物產(chǎn)生抗藥性。因此，尋求和開(kāi)發(fā)對(duì)全球環(huán)境以及人類(lèi)健康無(wú)危害的天然殺菌防腐劑來(lái)抑制采后病害成為大勢(shì)所趨。

枯草芽孢桿菌（）是一種有益的生防細(xì)菌，具有較強(qiáng)的生防作用，其作用機(jī)制包括競(jìng)爭(zhēng)作用和拮抗作用。競(jìng)爭(zhēng)作用主要是對(duì)空間以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的爭(zhēng)奪，拮抗作用是指微生物自身在正常的生命活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的部分代謝產(chǎn)物會(huì)作用于致病菌的細(xì)胞器，影響致病菌正常生命活動(dòng)，導(dǎo)致致病菌不能正常生長(zhǎng)繁殖?？莶菅挎邨U菌屬的部分代謝物已被證明具有抗真菌活性，在各種芽孢桿菌中，枯草芽孢桿菌已被徹底開(kāi)發(fā)作為許多植物疾病的生物防治劑。胡陳云等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌ge25分泌的抑菌脂肽嚴(yán)重影響人參黑斑菌和人參銹腐菌菌絲體的正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌絲體形態(tài)異常、發(fā)育畸形。Ren Jianjun等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物XB-1對(duì)桃褐腐病菌有明顯的抑制作用。吡啶-2,6-二羧酸（pyridine-2,6-dipicolinic acid，DPA）是從枯草芽孢桿菌168的分泌物中分離出的一種新的抗真菌化合物，其作為細(xì)菌芽孢特有的化合物而成為生物標(biāo)志物，廣泛存在于芽孢中，占芽孢干質(zhì)量的5%～15%。吡啶二羧酸有5種結(jié)構(gòu)不同代謝產(chǎn)物，其中，吡啶-2,3-二羧酸和DPA是芽孢桿菌分泌物中的常見(jiàn)代謝產(chǎn)物，課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DPA的抑菌效果最佳。從結(jié)構(gòu)上看，吡啶二羧酸屬于吡啶類(lèi)雜環(huán)化合物。這種化合物具有高效、毒性低等優(yōu)異的生物活性，從而成為綠色抑菌劑研制的新方向。另外，在生產(chǎn)生活中這類(lèi)化合物應(yīng)用廣泛，農(nóng)業(yè)上可用于殺菌、除草、殺蟲(chóng)；用于醫(yī)藥上，具有抗癌、消炎、降低血糖等優(yōu)點(diǎn)。Song Xuege等研究發(fā)現(xiàn)5 mmol/L的DPA在pH 5.6時(shí)，通過(guò)抑制幾丁質(zhì)的合成而顯著抑制生長(zhǎng)，在預(yù)防性應(yīng)用中，DPA可將梨樹(shù)的潰瘍病發(fā)病率減少90%。目前吡啶二羧酸的相關(guān)研究較少，且DPA在果蔬采后病害控制中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)使用DPA來(lái)處理黑斑病菌，研究DPA對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用，并進(jìn)一步深入探討其可能的抑菌機(jī)理，同時(shí)還用DPA對(duì)早酥梨果實(shí)進(jìn)行處理，探究DPA對(duì)黑斑病的控制作用，以期拓寬DPA適用范圍，為DPA投入市場(chǎng)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時(shí)為控制早酥梨采后病害提供一種新的天然防腐殺菌劑。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

供試菌株為課題組前期研究分離得到，現(xiàn)保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

早酥梨采摘于甘肅省景泰縣條山農(nóng)場(chǎng)，挑選大小相近（質(zhì)量約200～250 g）、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)，采摘當(dāng)天運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，靜置24 h散去田間熱后，于冷庫(kù)（（3f2）℃、相對(duì)濕度85%）中貯藏待用。

DPA購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1510型酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾儀器有限公司；H-1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；DDS-370微型電導(dǎo)儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BX51型熒光顯微鏡 日本Olympus公司；CentriVap真空離心濃縮儀 美國(guó)Labconco公司；ACQUITY Arc四元梯度超快速液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1孢子懸浮液的配制

參照文獻(xiàn)[17]的方法并略作修改，在超凈工作臺(tái)中向培養(yǎng)5 d的培養(yǎng)皿中倒入少量含有體積分?jǐn)?shù)0.01% Tween-80的無(wú)菌水，用已滅菌的涂布器輕刮菌絲，將所得溶液通過(guò)4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾到三角瓶中，并配制成1h10個(gè)/mL孢子懸浮液待用。

1.3.2菌絲的收集

取1 mL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個(gè)/mL）接種至100 mL馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)36 h后，用布氏漏斗過(guò)濾收集菌絲備用，菌絲用無(wú)菌水洗滌3 次，以除去培養(yǎng)液。

1.3.3 DPA處理及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.3.1 DPA處理及菌落生長(zhǎng)評(píng)價(jià)

參照文獻(xiàn)[18]的方法并稍作修改。分別稱取8.3、16.7、33.4、66.8 mg DPA并溶解于100 mL融化的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基中，得到含0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L DPA的PDA培養(yǎng)基，以未添加DPA的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照組，待培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)基中心分別接種2 μL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個(gè)/mL），28 ℃避光培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)3、5、7、9 d時(shí)觀察菌落形態(tài)并采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3.3.2孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]的方法并稍作修改。取1 mL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個(gè)/mL），8 000 r/min離心2 min，棄去上清液，向沉淀中分別加入1 mL不同濃度（0（對(duì)照組）、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L）的DPA溶液，振蕩搖勻。將PDA培養(yǎng)基裁成圓形（＝0.5 mm）放置于滅過(guò)菌的載玻片上，培養(yǎng)基中央滴加20 μL上述含有不同濃度DPA的孢子懸浮液，分別于28 ℃孵育2、4、6、8 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，同時(shí)通過(guò)IS Capture軟件測(cè)量芽管長(zhǎng)度。每次觀察，孢子總數(shù)為100個(gè)，重復(fù)3 次。按式（1）計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.3.4 DPA處理早酥梨及病斑直徑的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[20]的方法并稍作修改。將挑選好的早酥梨果實(shí)用2%（體積分?jǐn)?shù)）的NaClO溶液浸泡2 min，然后用蒸餾水沖洗除去果實(shí)表面NaClO溶液，果實(shí)晾干后用75%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液擦拭果實(shí)表皮。隨后用鐵釘在果實(shí)赤道部位均勻地打3個(gè)孔，每孔接種20 μL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個(gè)/mL），室溫晾干后分別向每個(gè)孔中加入20 μL濃度為0（即對(duì)照組）、5.0、10.0、20.0 mmol/L的DPA溶液，每組9個(gè)果實(shí)，各組處理好的果實(shí)放入分別放入紙箱（60 cmh60 cmh90 cm）中，在每個(gè)紙箱中放入一張濕潤(rùn)的濾紙，以提供果實(shí)發(fā)病所需的濕度，于室溫條件下避光貯藏。在貯藏3、5、7、9、11 d觀察果實(shí)病斑并采用十字交叉法測(cè)量果實(shí)的病斑直徑。

1.3.5細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[21]并稍作修改。將1 mL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個(gè)/mL）置于2 mL無(wú)菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，棄去上清液，在沉淀中加入1 mL濃度分別為0（即對(duì)照組）、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L的DPA溶液，在28 ℃培養(yǎng)箱溫育2 h，8 000 r/min離心2 min，棄去上清液，孢子沉淀中加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.0，后同），室溫下避光靜置30 min，然后8 000 r/min離心2 min，棄去上清液，向孢子沉淀中加入1 mL PBS和10 μL碘化丙啶染液（propidium iodide，PI）（1 mg/mL），避光靜置20 min，然后8 000 r/min離心2 min，棄去上清液。最后加入1 mL PBS洗滌（8 000 r/min離心2 min），洗滌3 次后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞膜完整性并按式（2）計(jì)算PI染色率。

1.3.6細(xì)胞膜通透性的測(cè)定

1.3.6.1菌絲電導(dǎo)率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[22]的方法并進(jìn)行一定的修改。分別測(cè)定濃度為0（即對(duì)照組）、0.5、1.0、2.0 mmol/L DPA溶液的電導(dǎo)率；稱取1 g 1.3.2節(jié)所得的菌絲，分別添加至10 mL上述濃度的DPA溶液中，室溫下靜置，測(cè)定處理0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時(shí)相應(yīng)的電導(dǎo)率。按式（3）計(jì)算菌絲電導(dǎo)率。

1.3.6.2核酸滲漏量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[23]的方法并進(jìn)行一定的修改。分別測(cè)定濃度為0（即對(duì)照組）、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L DPA溶液在260 nm波長(zhǎng)處的吸光度；稱取1 g 1.3.2節(jié)所得的菌絲，分別加入到2 mL上述不同濃度的DPA溶液中，分別在室溫下放置0、1、2、3、4 h取樣，8 000 r/min離心5 min后收集上清液，測(cè)定260 nm波長(zhǎng)處吸光度。按式（4）計(jì)算核酸滲漏量。

1.3.6.3蛋白質(zhì)滲漏量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[24]的方法并進(jìn)行一定的修改。分別測(cè)定濃度為0（即對(duì)照組）、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L DPA溶液在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度；稱取1 g 1.3.2節(jié)所得的菌絲，分別加入到2 mL上述不同濃度的DPA溶液中，分別在室溫下放置0、1、2、3、4 h后取樣，8 000 r/min離心5 min收集上清液，在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按式（5）計(jì)算蛋白質(zhì)滲漏量。

1.3.7細(xì)胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[25]的方法并稍作修改。菌絲的培養(yǎng)：分別配制含不同濃度（0（即對(duì)照組）、1.0、2.0 mmol/L）DPA的PDA培養(yǎng)基各100 mL，在培養(yǎng)基的中央分別接種2 μL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個(gè)/mL），28 ℃避光培養(yǎng)；培養(yǎng)至第5天，用已滅菌的取樣勺輕輕刮取PDA培養(yǎng)基上的菌絲（盡量不要刮到培養(yǎng)基），將菌絲置于研缽中，加液氮研磨得到菌粉。麥角甾醇的提?。悍Q取0.1 g研磨后的菌粉，加入3 mL 25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氫氧化鉀-醇溶液（甲醇與乙醇體積比為3∶2），渦旋振蕩1 min，然后85 ℃水浴1 h；室溫冷卻后加入1 mL無(wú)菌水和3 mL正戊烷渦旋振蕩3 min，室溫靜置10 min，待其分層后吸取上清液，在真空離心濃縮儀中干燥，將干燥后的產(chǎn)物溶于1 mL甲醇（色譜純）中，用0.45 μm孔徑的濾膜過(guò)濾后置于1.5 mL進(jìn)樣瓶中，－20 ℃保存。采用高效液相色譜法測(cè)定麥角甾醇質(zhì)量濃度，色譜柱為C柱（250 mmh4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為100%甲醇（色譜純）；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；流速為1 mL/min；紫外檢測(cè)器檢測(cè)；檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm。

1.3.8 丙二醛濃度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[26]的方法并進(jìn)行一定修改。稱取0.1 g 1.3.2節(jié)制得菌絲于2 mL試管中，分別加入1.5 mL濃度為0（即對(duì)照組）、1.0、2.0 mmol/L的DPA溶液，分別在室溫下處理2、4 h后，8 000 r/min離心5 min。取1 mL上清液，再加入1 mL硫代巴比妥酸試劑，沸水浴15 min，待冷卻至室溫后8 000 r/min離心5 min，分別測(cè)定上清液在450、532、600 nm波長(zhǎng)處的吸光度、、。按式（6）計(jì)算丙二醛濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件處理，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用OriginPro 8.5軟件作圖，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。采用Duncan’s事后檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPA處理對(duì)A.alternata生長(zhǎng)的影響

2.1.1 DPA處理對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，DPA處理能顯著抑制菌落的生長(zhǎng)（＜0.05），且抑制效果隨處理濃度的增加而增強(qiáng)。同時(shí)DPA處理使菌絲的顏色變淺（圖1A）。2.0 mmol/L的DPA處理9 d后菌落直徑僅為對(duì)照組的51.76%，當(dāng)DPA濃度為4.0 mmol/L時(shí)，菌落生長(zhǎng)完全受到抑制（圖1B）。

圖1 DPA處理對(duì)A.alternata菌落形態(tài)（A）和菌落直徑（B）的影響Fig.1 Effect of DPA treatment on mycelium morphology (A) and colony diameter (B) of A.alternata

2.1.2 DPA處理對(duì)孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)的影響

DPA處理能有效抑制的孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)（圖2），且其抑制效果隨處理濃度的增加而增強(qiáng)。培養(yǎng)6 h，對(duì)照組孢子萌發(fā)率達(dá)90%，芽管長(zhǎng)度已達(dá)494.278 μm。而4.0 mmol/L DPA處理6 h后僅有27.67%的孢子萌發(fā)，芽管長(zhǎng)度僅為121.657 μm。

圖2 DPA處理對(duì)A.alternata孢子萌發(fā)率（A）和芽管長(zhǎng)度（B）的影響Fig.2 Effect of DPA treatment on spore germination rate (A) and germ tube elongation (B) of A.alternata

2.2 DPA處理對(duì)早酥梨黑斑病的控制效果

DPA處理對(duì)早酥梨黑斑的擴(kuò)展有抑制作用，且處理濃度越大抑制效果越佳（圖3A）。但與在PDA平板上所用濃度不同，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20.0 mmol/L DPA處理才能有效地控制早酥梨的黑斑病。處理前期（第3、5天），5.0 mmol/L DPA處理組與對(duì)照組病斑直徑差異不顯著。貯存至第11天時(shí)，對(duì)照組早酥梨病斑直徑為4.06 cm，而20.0 mmol/L DPA處理組早酥梨病斑直徑（2.24 cm）僅為對(duì)照組的55.17%（圖3B）。

圖3 DPA處理對(duì)早酥梨病斑外觀（A）和病斑直徑（B）的影響Fig.3 Effect of DPA treatment on the development of black spot disease (A) and lesion diameter (B) on Zaosu pear fruit

2.3 DPA處理對(duì)A.alternata細(xì)胞膜完整性的影響

為了進(jìn)一步探索DPA潛在的抗真菌機(jī)理，用PI染液檢測(cè)細(xì)胞膜完整性，PI是一種膜不可滲透的熒光染料，在熒光顯微鏡下，PI染料將失去膜完整性的細(xì)胞染為紅色。對(duì)照組中僅有個(gè)別孢子細(xì)胞膜被破壞，發(fā)出微弱紅光，而DPA處理組孢子隨DPA濃度的增大紅光逐漸增強(qiáng)（圖4A）。4.0 mmol/L DPA處理組孢子PI染色率是對(duì)照組的8.78 倍（圖4B）。

圖4 DPA處理后PI染色檢測(cè)A.alternata細(xì)胞膜完整性（A）和PI染色率（B）Fig.4 Cell membrane integrity (A) and propidium iodide (PI) staining percentage (B) of A.alternata after DPA treatment

2.4 DPA處理對(duì)A.alternata細(xì)胞膜透性的影響

2.4.1 對(duì)菌絲電導(dǎo)率的影響

如圖5所示，電導(dǎo)率代表溶液中離子強(qiáng)度的大小，所以電導(dǎo)率的改變可以在一定程度上反映細(xì)胞膜透性的改變。DPA處理組菌絲電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照組（＜0.05），且DPA處理濃度越大，菌絲電導(dǎo)率越大。在處理0.5 h內(nèi)各處理組菌絲電導(dǎo)率均迅速上升，隨后變化趨于平穩(wěn)。處理3 h后，2.0 mmol/L DPA處理組菌絲體電導(dǎo)率為對(duì)照組的6.84 倍。

圖5 DPA處理對(duì)A.alternata菌絲電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of DPA treatment on membrane conductivity of A.alternata mycelia

2.4.2 對(duì)核酸滲漏量的影響

如圖6所示，DPA處理組菌絲核酸滲漏量顯著高于對(duì)照組（＜0.05），且隨著處理濃度增加以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。處理前1 h內(nèi)，各處理組核酸滲漏量均迅速升高且差異顯著，4.0 mmol/L DPA處理組菌絲核酸滲漏量為對(duì)照組的6.23 倍。1 h后各處理組核酸滲漏量緩慢上升，處理4 h時(shí)，4.0 mmol/L DPA處理組菌絲的核酸滲漏量為對(duì)照組的2.67 倍。

圖6 DPA處理對(duì)A.alternata核酸滲漏量的影響Fig.6 Effect of DPA treatment on nucleic acid leakage from A.alternata

2.4.3 對(duì)蛋白質(zhì)滲漏量的影響

如圖7所示，DPA處理組菌絲蛋白質(zhì)滲漏量顯著高于對(duì)照組（＜0.05），且DPA處理濃度越大蛋白質(zhì)滲漏量越大。處理前1 h內(nèi)，各處理組蛋白質(zhì)滲漏量均迅速升高且差異顯著，4.0 mmol/L DPA處理菌絲蛋白質(zhì)滲漏量為對(duì)照組的32.06 倍。1 h后各處理組變化趨于平穩(wěn)，處理4 h時(shí)，4.0 mmol/L DPA處理菌絲蛋白質(zhì)滲漏量為對(duì)照組的8.99 倍。

圖7 DPA處理對(duì)A.alternata蛋白質(zhì)滲漏量的影響Fig.7 Effect of DPA treatment on protein leakage from A.alternata

2.5 DPA處理對(duì)A.alternata細(xì)胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度的影響

在真菌細(xì)胞膜中，麥角甾醇是必不可少的一種成分，其不僅確保了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，而且在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、保證細(xì)胞膜正常流動(dòng)以及確保完成細(xì)胞內(nèi)正常生理代謝活動(dòng)等方面均有重要作用。一旦麥角甾醇不能正常合成，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能都會(huì)受到一定影響，從而會(huì)直接導(dǎo)致菌體死亡。如圖8所示，隨DPA處理濃度增加，菌絲的細(xì)胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度顯著降低。對(duì)照組菌絲細(xì)胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度為39.90 μg/mL，而1.0、2.0 mmol/L的DPA處理組菌絲細(xì)胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度顯著降低（＜0.05），分別為32.56、19.51 μg/mL。

圖8 DPA處理對(duì)A.alternata細(xì)胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度的影響Fig.8 Effect of DPA treatment on ergosterol content in A.alternata cell membrane

2.6 DPA處理對(duì)A.alternata丙二醛濃度的影響

丙二醛濃度是反映膜脂過(guò)氧化程度的指標(biāo)之一。DPA處理可以使丙二醛濃度增加（圖9），并且隨處理濃度增加以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。處理4 h時(shí)，2.0 mmol/L DPA處理組丙二醛濃度為對(duì)照組的1.32 倍。

圖9 DPA處理對(duì)A.alternata丙二醛濃度的影響Fig.9 Effect of DPA treatment on malondialdehyde content in A.alternata

3 討 論

生防菌枯草芽孢桿菌的許多代謝產(chǎn)物已被證實(shí)具有抗真菌活性。Wang Nana等在枯草芽孢桿菌E1R-J發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物EP-2。EP-2作為一種抗真菌肽，在100 ℃高溫30 min、pH 1.0～8.0范圍內(nèi)，或在金屬離子（如Cu、Zn、Mg）存在條件下表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗真菌活性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)EP-2可通過(guò)引起菌絲腫脹、扭曲、異常及原生質(zhì)體外滲來(lái)抑制的生長(zhǎng)，從而有效控制蘋(píng)果的腐爛病。劉剛等在枯草芽孢桿菌Loq18的代謝產(chǎn)物中純化出一種新型抗菌蛋白，該抗菌蛋白會(huì)使灰葡萄孢菌絲斷裂或畸形，同時(shí)抑制孢子萌發(fā)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)對(duì)照組果實(shí)腐爛率達(dá)到100%時(shí)，經(jīng)抗菌蛋白處理組草莓和葡萄果實(shí)的腐爛率分別為60.33%和45.33%。劉雙等將草莓根腐病菌C16-4用枯草芽孢桿菌T4-4、S-30和S-11菌株和代謝產(chǎn)物進(jìn)行相應(yīng)處理，結(jié)果表明處理組病菌分生孢子的產(chǎn)生與萌發(fā)受到了抑制。另外，通過(guò)掃描電子顯微鏡還觀察到處理組菌絲細(xì)胞壁表面粗糙，出現(xiàn)細(xì)胞膨大、扭曲等畸形現(xiàn)象。DPA是枯草芽孢桿菌菌株中168的分泌物，為探究DPA抑菌效果及機(jī)理，Song Xuege等通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有DPA的情況下，細(xì)胞呈圓形形態(tài)；而當(dāng)經(jīng)5 mmol/L DPA處理24 h后，細(xì)胞膜上產(chǎn)生孔，說(shuō)明DPA通過(guò)破壞真菌細(xì)胞膜從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另外，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)3.0 mmol/L DPA處理減少了分生孢子的數(shù)量，但仍有部分孢子萌發(fā)，而5.0 mmol/L的DPA在pH 5.6的環(huán)境下時(shí)，可完全抑制的菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)。同樣本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4.0 mmol/L DPA處理完全抑制了的菌落生長(zhǎng)，且抑制了孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)，表明不同病原真菌對(duì)DPA的敏感性存在差異，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20.0 mmol/L DPA處理才能有效地控制早酥梨的黑斑病，這可能是果實(shí)表皮組織對(duì)藥物作用的影響，因此需進(jìn)一步優(yōu)化和規(guī)范DPA的采后處理方法，提高藥物的作用效果。

為進(jìn)一步探討DPA對(duì)的抑菌機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)用PI染液測(cè)定了細(xì)胞膜的完整性，PI染液可以通過(guò)受損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與胞內(nèi)核酸等物質(zhì)結(jié)合，使其發(fā)出紅光。PI染色結(jié)果表明DPA處理組PI染色率遠(yuǎn)高于對(duì)照組，說(shuō)明DPA破壞了細(xì)胞膜的完整性。一些吡啶類(lèi)環(huán)狀化合物也有類(lèi)似破壞細(xì)胞膜的抑菌機(jī)理，如氟啶酰菌胺能夠與病原菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架間特異性蛋白結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而表現(xiàn)出殺菌活性。同時(shí)DPA處理組菌絲電導(dǎo)率、核酸和蛋白質(zhì)的外滲量均顯著增加，表明DPA處理提高了細(xì)胞膜的通透性，造成細(xì)胞膜跨膜電勢(shì)紊亂，導(dǎo)致離子外流，致使電導(dǎo)率提高。這與枯草芽孢桿菌21代謝物引起大豆茄鐮孢菌菌液電導(dǎo)率升高，顯示出膜透性改變這一相似結(jié)果。同時(shí)胞內(nèi)一些物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)等也因細(xì)胞膜通透性增加而外流，使一定波長(zhǎng)處的吸光度增大。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜重要組成部分，其能保證細(xì)胞膜流動(dòng)性、細(xì)胞活力以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常運(yùn)輸，結(jié)果表明，DPA處理導(dǎo)致細(xì)胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度顯著降低，這也是其導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加的原因。DPA抑制細(xì)胞膜上麥角甾醇合成可能是因其具有雜環(huán)結(jié)構(gòu)。趙圣印等研究發(fā)現(xiàn)雜環(huán)上的氮原子可通過(guò)形成配位鍵與甾醇14-脫甲基酶P450的血紅素-鐵活性中心連接，酶的活性受到抑制。而該酶又正是合成麥角甾醇的關(guān)鍵酶，當(dāng)它活性受到抑制后，麥角甾醇將不能正常地合成，病原菌細(xì)胞膜完整性遭到破壞，不能進(jìn)行正常生命活動(dòng)，從而導(dǎo)致病原菌死亡。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)DPA處理可促使膜脂發(fā)生過(guò)氧化，丙二醛濃度增加，引起細(xì)胞膜氧化損傷，從而抑制了病原菌的生長(zhǎng)。另外Song Xuege等研究還發(fā)現(xiàn)3.0 mmol/L的DPA處理3 d后會(huì)抑制細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的合成，表明DPA對(duì)真菌細(xì)胞壁也具有一定的影響，可見(jiàn)DPA的抑菌機(jī)理具有復(fù)雜性和多樣性，具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步揭示。

綜上，DPA處理可以有效抑制的菌落生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)，且能有效控制早酥梨黑斑病的擴(kuò)展，其作用效果存在濃度依賴性。進(jìn)一步研究表明DPA可通過(guò)破壞細(xì)胞膜的完整性、提高膜通透性、抑制膜組分麥角甾醇的合成和促使膜質(zhì)氧化進(jìn)而顯著抑制的生長(zhǎng)。