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    兼具抗氧化及抗菌活性的玉米醇溶蛋白肽制備及其乳化特性

    2022-07-02 03:49:16唐文婷孫慶杰王洪彩蒲傳奮
    食品科學 2022年11期
    關(guān)鍵詞:乳液清除率蛋白酶

    唐文婷,孫 玥,孫慶杰,王洪彩,蒲傳奮,*

    (1.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,山東 青島 266109;2.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司,山東 德州 251200)

    食品乳液體系一般由水及油兩種不相溶體系混合而成,常見的單層乳液根據(jù)分散相的不同可分為水包油(oil in water,O/W)和油包水(water in oil,W/O)兩種類型。乳液為熱力學不穩(wěn)定體系,在貯藏過程中因多種理化因素影響,易出現(xiàn)絮凝、奧斯瓦爾德熟化、脂肪上?。ǚ謱樱?、聚結(jié)和相轉(zhuǎn)化等常見的熱力學不穩(wěn)定現(xiàn)象。為了維持乳液穩(wěn)定,通常通過加入乳化劑降低界面張力。食品蛋白因其來源廣泛、營養(yǎng)安全、具有一定的乳化性能,已應(yīng)用于食品乳液中。在蛋白穩(wěn)定的乳液體系中,蛋白吸附至油-水界面,降低了油-水界面張力,促進了油相在水相中的分散,抑制了液滴凝聚。蛋白的結(jié)構(gòu)、氨基酸組成、吸附量、帶電特性都會影響乳液的外觀及貯藏穩(wěn)定性。植物蛋白(大豆蛋白、大米蛋白、玉米蛋白、小麥蛋白等)及動物蛋白(酪蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白等)均已被用于乳液的穩(wěn)定。

    食品乳液的連續(xù)相、界面層及分散相的成分各異,在加工貯藏過程中極易發(fā)生各種理化變化。如油脂在乳液中會發(fā)生水解或氧化等化學變化;界面層乳化劑可能會發(fā)生可逆性的界面吸附行為;而水相中則含有金屬離子或者高濃度的鹽、糖等,這些物質(zhì)的存在可能對乳液的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。除熱力學不穩(wěn)定因素外,乳液的微生物穩(wěn)定性及油脂的氧化穩(wěn)定性是乳液類產(chǎn)品的關(guān)注熱點。在諸多乳液研究中,常添加氮化鈉用于抑制乳液的微生物生長,但疊氮化鈉有劇毒,顯然不能添加于食品中。目前,構(gòu)建具有抑菌功效的食源性乳液的策略主要是采用具有抑菌作用的植物精油作為油相,如雪松精油、百里香精油、丁香精油等。此外,在抑制乳液脂質(zhì)氧化方面,使用蛋白和多酚復(fù)合物被證實可有效抑制油脂的氧化。如Zhao Tiantian等分別采用鳀魚蛋白水解物和兒茶素、沒食子酸、單寧酸的復(fù)合物抑制魚油乳液的脂質(zhì)氧化。Jia Xiao等證實大米蛋白和阿魏酸的復(fù)合物能夠降低乳液貯藏過程中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物üü過氧化氫、硫代巴比妥酸反應(yīng)物和己醛的濃度,提高乳液的脂質(zhì)氧化穩(wěn)定性。綜上,開發(fā)同時具有抗氧化及抗菌功效的食源性蛋白類乳化劑,可為食源性蛋白在乳液食品中的潛在多功能應(yīng)用提供理論參考,還可拓展新型蛋白乳液類食品的品類。

    玉米醇溶蛋白為玉米深加工的主要副產(chǎn)品之一,是一種天然植物蛋白,含有50%以上的疏水性氨基酸,其中亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸的含量較高,因此疏水性較高。玉米醇溶蛋白經(jīng)酶水解后,可獲得具有抗氧化、降糖、醒酒等多種生理功效的小分子肽。采用玉米醇溶蛋白及其水解產(chǎn)物穩(wěn)定乳液已有關(guān)報道。但尚鮮見乳液制劑中耦合蛋白肽的抗氧化及抗菌性能的相關(guān)研究。且已有的玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物主要集中于水解所得混合肽類的蛋白水解物,而非確定氨基酸序列的蛋白肽。

    因此,本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上,采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解玉米醇溶蛋白,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率、大腸桿菌()抑制率和乳化活性指數(shù)為指標,比較不同水解時間產(chǎn)物的抗氧化性及抗菌性能。以抗氧化、抗菌活性最高的組分為篩選對象,采用?KTA蛋白純化系統(tǒng)和反相高效液相色譜分離純化出單一組分,并經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定其氨基酸序列。分別驗證制備色譜收集和合成肽的雙抗活性及乳化性能,并評價其穩(wěn)定的O/W型乳液的貯藏穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性和抗菌性能。研究結(jié)果可為新型綠色食源性蛋白肽類乳化劑的開發(fā)及應(yīng)用提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、材料與試劑

    菌株:大腸桿菌()、金黃色葡萄球菌()、枯草芽孢桿菌()、單核細胞增生李斯特菌()(以下簡稱單增李斯特菌),由青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院微生物實驗室提供。

    玉米醇溶蛋白(純度92%) 上海金穗生物科技有限公司;玉米油 中糧集團有限公司;LB培養(yǎng)基杭州微生物試劑有限公司;胰蛋白酶(1∶250)、木瓜蛋白酶(>200 U/mg) 上海麥克林生化科技有限公司;Spectra/Por透析袋(截留分子質(zhì)量為100 Da)美國Spectrum公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(純度98%)、VC(純度99%)、2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid),ABTS)(純度98%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乳酸鏈球菌素(Nisin) 山東元泰生物工程有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    YXQ-30SII全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-2D超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LRH-70恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒儀器有限公司;BKPOLR電子顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司;Free Zone 2.5冷凍干燥機 美國Labconco公司;?KTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司;高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)系統(tǒng) 美國Agilent公司;PREP 150LC制備型液相色譜儀、MALDI SYNAPT QTof MS基質(zhì)輔助激光解析電離四極桿飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry,MALDI Q-TOF MS)儀 美國Waters公司;BS-16A自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司;Infinite F50酶標儀 瑞士Tecan公司;Mastersizer 2000激光粒度分析儀英國Malvern公司。

    1.3 方法

    1.3.1 玉米醇溶蛋白水解物的制備

    1.3.1.1 玉米醇溶蛋白胰蛋白酶水解產(chǎn)物的制備

    在預(yù)實驗基礎(chǔ)上,配制6 g/100 mL玉米醇溶蛋白分散液(800 mL),調(diào)節(jié)pH值至8.0,磁力攪拌條件下加入底物質(zhì)量2%的胰蛋白酶,采用pH-state法于37 ℃反應(yīng)2 h,分別于0、10、20、30、60、120 min取出100 mL,沸水浴加熱10 min鈍化蛋白酶,調(diào)節(jié)pH值至7.0。所得水解產(chǎn)物離心15 min(10 000h、4 ℃),上清液經(jīng)100 Da透析袋透析,凍干備用。

    1.3.1.2 玉米醇溶蛋白木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的制備

    在預(yù)實驗基礎(chǔ)上,配制6 g/100 mL玉米醇溶蛋白分散液(800 mL),調(diào)節(jié)pH值至6.0,磁力攪拌條件下加入底物質(zhì)量1.5%的木瓜蛋白酶,采用pH-state法于40 ℃反應(yīng)2 h,分別于0、10、20、30、60、120 min取出100 mL,沸水浴加熱10 min鈍化蛋白酶,調(diào)節(jié)pH值至7.0。所得水解產(chǎn)物離心15 min(10 000h、4 ℃),上清液經(jīng)截留分子質(zhì)量100 Da透析袋透析,凍干備用。

    1.3.2 玉米醇溶蛋白水解物的分離純化

    根據(jù)DPPH自由基清除率和抑菌率的實驗結(jié)果,分別采用凝膠色譜和反相色譜對玉米醇溶蛋白木瓜蛋白酶水解60 min的產(chǎn)物進行分離。使用?KTA蛋白純化系統(tǒng)(配有SuperdexSuperdex peptide 10/300GL型凝膠柱)對卵白玉米醇溶蛋白水解物進行粗分。分別采用2 倍柱體積的體積分數(shù)20%乙醇溶液、超純水、體積分數(shù)30%乙腈溶液(含0.1%三氟乙酸)對凝膠柱進行洗脫平衡。蛋白水解物配成10 mg/mL溶液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上樣(0.5 mL)。采用體積分數(shù)30%乙腈溶液(含0.1%三氟乙酸)以0.5 mL/min流速洗脫2 倍柱體積。檢測波長220 nm,自動收集器收集各吸收峰對應(yīng)組分,并冷凍干燥。將上述各吸收峰對應(yīng)凍干組分配成2 mg/mL的溶液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后采用反相HPLC(配有Kromasil C柱(250 mmh10 mm))分離。色譜條件:柱溫25 ℃,流動相A為體積分數(shù)0.1%三氟乙酸溶液,流動相B為含0.1%三氟乙酸的體積分數(shù)80%乙腈溶液,流速0.5 mL/min,線性梯度洗脫(30 min內(nèi)0~100% B),紫外檢測波長215 nm。色譜分離過程中,收集各吸收峰對應(yīng)的組分,凍干、復(fù)溶并檢測其DPPH自由基清除率和抑菌率。

    1.3.3 玉米醇溶蛋白氨基酸序列鑒定

    純化所得反相色譜單峰所對應(yīng)的組分采用MALDI Q-TOF MS進行氨基酸序列分析。圖譜采用正離子(ESI+)采集模式。質(zhì)譜條件為源溫度100 ℃;毛細管電壓3.5 kV;檢測電壓1 700 V;錐孔電壓40 V;錐孔氣流速500 L/h;脫溶劑溫度300 ℃;脫溶劑氣流速300 L/h;碰撞能量6 eV。質(zhì)譜所得數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件Masslynx V4.1進行氨基酸序列分析。

    1.3.4 抗氧化性質(zhì)測定

    1.3.4.1 DPPH自由基清除率

    根據(jù)周濃等的方法稍作修改測定DPPH自由基清除率。取1 mL樣品溶液(0.5 mg/mL)與2 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液充分混合,并于室溫下避光反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后,以等體積乙醇代替樣品加入到DPPH-乙醇溶液中作為空白,在517 nm波長處測定樣品吸光度。樣品DPPH自由基清除率按公式(1)計算。

    式中:為樣品+DPPH-乙醇溶液的吸光度;為樣品+不含DPPH的乙醇溶液的吸光度;為等體積乙醇代替樣品+DPPH-乙醇溶液的吸光度。

    1.3.4.2 ABTS陽離子自由基清除率

    將ABTS固體粉末溶于10 mL的pH 7.4、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),使ABTS終濃度為2.45 mmol/L。然后向其中加入0.006 6 g過硫酸鉀,避光保存16 h后作為ABTS工作液。將1 mL樣品溶液(0.5 mg/mL)與3.0 mL ABTS工作液充分混合,避光反應(yīng)5 min,使用磷酸鹽緩沖液替代樣品作為空白,以不含ABTS的PBS為對照,在734 nm波長處測定樣品吸光度。樣品的ABTS自由基清除率按公式(2)計算。

    式中:為樣品+ABTS工作液的吸光度;為樣品+不含ABTS的PBS的吸光度;為PBS+ABTS工作液的吸光度。

    1.3.4.3 鐵離子還原能力

    樣品的鐵離子還原能力采用Jin Hua等的方法進行測定。取0.2 mL樣品溶液(0.5 mg/mL)與1.0 mL質(zhì)量分數(shù)1%鐵氰化鉀溶液混合?;旌衔镌?0 ℃下保溫20 min后冷卻至室溫。再將1.0 mL的質(zhì)量分數(shù)10%三氯乙酸溶液添加至上述混合物中,10 000h離心15 min。取上清液,采用去離子水稀釋2 倍,之后加入400 μL質(zhì)量分數(shù)0.1% FeCl溶液。旋渦振蕩均勻并靜置10 min后,在700 nm波長處測定吸光度,以等體積的水代替樣品溶液作為空白對照,以樣品溶液與空白對照吸光度的差(Δ)表示樣品還原能力。

    上述抗氧化活性分析中以相同濃度的VC作為陽性對照,以不含肽的PBS(0.1 mol/L、pH 7.4)作為陰性對照。

    1.3.5 抑菌活性的測定

    1.3.5.1 最小抑菌濃度的測定

    通過微量稀釋法測定樣品對指示菌的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)。離心(4 000 r/min、4 ℃、20 min)收集菌體,采用滅菌PBS洗滌3 次并將菌體濃度重懸至1h10CFU/mL。將玉米醇溶蛋白肽通過滅菌PBS(10 mmol/L、pH 7.2)配制成1.024 mg/mL的母液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌,并用滅菌PBS梯度稀釋至不同質(zhì)量濃度。分別將50 μL不同質(zhì)量濃度肽溶液、100 μL受試菌液和100 μL培養(yǎng)基移入滅菌平底96 孔板,振蕩均勻后于37 ℃培養(yǎng)24 h,酶標儀測定每孔OD。陽性對照組采用Nisin,陰性對照組采用等體積不含肽的PBS。與初始值相比,OD不再增加的樣品最小濃度即為MIC。

    1.3.5.2 抑菌率的測定

    采用液體培養(yǎng)法測定玉米醇溶蛋白肽的抑菌效果。培養(yǎng)至對數(shù)期的待測菌株離心(4 000 r/min、4 ℃、20 min)并收集菌體,采用滅菌PBS(10 mmol/L、pH 7.2)洗滌3 次并重懸至菌體濃度為1h10CFU/mL。向滅菌96 孔板中依次加入100 μL培養(yǎng)基、100 μL菌懸液和50 μL經(jīng)過濾除菌的蛋白肽(50.0 μg/mL),以滅菌生理鹽水代替蛋白水解液作為空白組?;靹蚝笾糜?7 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,酶標儀測定OD,并按式(3)計算抑菌率。

    式中:OD為空白組OD;OD為樣品組OD。

    1.3.6 玉米醇溶蛋白肽的制備

    分別采用制備液相色譜和化學合成的方法制備玉米醇溶蛋白肽。制備液相色譜樣品按上述分離方法進行預(yù)處理,在最后色譜分離階段采用PREP 150LC制備型液相色譜分離制備并收集,色譜條件:流速:5 mL/min;檢測波長:214 nm;進樣量:3 mL;流動相A為超純水,流動相B為100%甲醇。洗脫程序:0~15 min,95%~90%流動相A;15~30 min,95%~90%流動相A;30~60 min,30%~10%流動相A。色譜柱為SunFire Prep COBD(19 mmh250 mm,5 μm)?;瘜W合成樣品采用固相合成法,委托上海楚肽生物科技有限公司合成。合成粗肽采用1.3.2節(jié)中HPLC法進行純化(純度≥95%),采用1.3.3節(jié)中MALDI Q-TOF MS法驗證合成肽的氨基酸序列。

    1.3.7 乳液制備

    將一定量的玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物用去離子水分散至1 g/100 mL,按油相體積分數(shù)10%加入玉米油,采用高速剪切(10 000 r/min)處理10 min,再采用探頭(探頭直徑6 mm)式超聲處理10 min(600 W,工作1 s,停止1 s),制備水包油乳液。

    1.3.8 乳化活性指數(shù)及乳化穩(wěn)定性測定

    玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物穩(wěn)定的乳液采用0.1%十二烷基硫酸鈉溶液稀釋100 倍,于500 nm波長處測定其吸光度,按式(4)計算乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index,EAI)。樣品于室溫下靜置10 min后再次于500 nm波長處測定吸光度,按式(5)計算乳化穩(wěn)定性(emulsion stability index,ESI)。作為比較,同時測定了吐溫-80穩(wěn)定的乳液的EAI和ESI。

    式中:為稀釋倍數(shù)(100);為蛋白的質(zhì)量濃度/(g/mL);為乳液油相體積分數(shù)/%;為樣品0 min的吸光度;為樣品10 min時的吸光度。

    1.3.9 乳液粒徑及Zeta-電位測定

    采用Zetasizer Nano-ZS90激光粒度儀測定乳液的粒徑、多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI)和Zeta-電位。為了避免多重光散射對測定的影響,采用去離子水稀釋樣品500 倍。連續(xù)相和分散相的折光指數(shù)分別為1.333和1.475,所有測試均在25 ℃下進行。每個樣品測定重復(fù)3 次,結(jié)果以平均值表示。

    1.3.10 乳液貯藏穩(wěn)定性分析

    將新制備的乳液在25 ℃下避光放置30 d,每5 d取出適量按照1.3.9節(jié)方法測定其粒徑、PDI和Zeta-電位。

    1.3.11 乳液氧化穩(wěn)定性分析

    1.3.11.1 過氧化值測定

    過氧化值(peroxide value,POV)的測定參考Jin Hua等的方法。將樣品置于45 ℃烘箱中加速氧化,于設(shè)定時間取出0.2 mL乳液與1.13 mL的異辛烷和0.37 mL的異丙醇混合,旋渦振蕩1 min后,5 000h離心30 min。離心結(jié)束后,取0.2 mL的異辛烷-異丙醇萃取液(下層)與1.87 mL甲醇和0.93 mL正丁醇混合。向混合液中加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸銨和15 μL亞鐵溶液并旋渦振蕩?;旌衔锉芄忪o置20 min后,于510 nm波長處測定吸光度。通過過氧化氫異丙苯質(zhì)量濃度-吸光度繪制標準曲線,計算樣品POV,單位為mg/kg。

    1.3.11.2 硫代巴比妥酸反應(yīng)物含量測定

    硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)含量測定參考Jin Hua等的方法并稍加修改。取乳液樣品和2.0 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液等體積混合并于沸水浴中反應(yīng)15 min。冷卻至室溫后,樣品以5 000h離心15 min。 取上清液,在532 nm波長處測定吸光度。通過丙二醛質(zhì)量濃度-吸光度繪制標準曲線確定樣品的TBARS含量。

    1.3.12 乳液抗菌性分析

    乳液的抗菌性能采用紙片擴散法評價。選擇培養(yǎng)至對數(shù)期的待測菌株,制備1h10CFU/mL的菌懸液。移取100 μL的菌懸液至固體培養(yǎng)基上,并均勻涂布。將直徑為6 mm的滅菌濾紙片浸入10 倍稀釋乳液中1 min,取出瀝去多余液體,并放置于涂布有菌懸液的培養(yǎng)基表面,于37 ℃下孵育24 h。孵育結(jié)束后,測定抑菌圈直徑。按式(6)計算乳液抑菌率。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗結(jié)果,表示為平均值±標準差。采用Origin軟件進行圖表繪制,采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力和E.coli抑菌率

    在預(yù)實驗基礎(chǔ)上,分別采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對玉米醇溶蛋白水解處理不同時間,并通過分析水解產(chǎn)物DPPH自由基清除能力和抑菌率評價各水解產(chǎn)物的抗氧化能力和抑菌能力。DPPH自由基是抗氧化活性評價中最常用的自由基之一,DPPH自由基含3個苯環(huán),苯環(huán)中間的氮原子上含一個孤對電子。在DPPH自由基清除實驗中,當DPPH自由基與具有抗氧化活性的物質(zhì)反應(yīng)時,該孤對電子被配對,DPPH的深紫色自由基被還原成非自由基形式而褪色。在自然界中分布廣泛,也存在于人和動物腸道中,為條件致病菌,故選取為評價指示菌。由圖1A可見,在水解前30 min內(nèi),玉米醇溶蛋白胰蛋白酶水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和抑菌率迅速增大至最大值。在之后的90 min水解時間內(nèi),胰蛋白酶水解產(chǎn)物的抑菌率由46.5%下降至19.8%;DPPH自由基清除率在30~60 min內(nèi)保持穩(wěn)定,之后在120 min時下降至59.8%。而木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物在60 min時表現(xiàn)出最高的DPPH自由基清除率和抑菌率,且其最大DPPH自由基清除率高于胰蛋白酶水解產(chǎn)物(圖1B)。兩種蛋白水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和抑菌率隨水解時間的差異性變化可能與蛋白酶的特異性作用位點及不同水解時間的水解度差異有關(guān)。胰蛋白酶的酶切位點為精氨酸和賴氨酸,木瓜蛋白酶優(yōu)先切割的位點為精氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸。水解時間的延長導致多肽水解程度及多肽產(chǎn)率增加,進而影響產(chǎn)物的分子質(zhì)量和多肽中親、疏水性氨基酸的組成。Kong Baohua等研究表明,玉米醇溶蛋白的堿性蛋白酶水解物具有較高的抗氧化能力,在較低濃度下可與丁基羥基茴香醚、-生育酚、抗壞血酸等抗氧化劑相媲美。研究發(fā)現(xiàn),玉米蛋白水解物的抗氧化能力與其分子質(zhì)量和疏水性有關(guān)。玉米醇溶蛋白的6種蛋白酶水解產(chǎn)物同樣具有抗菌活性,其中胃蛋白酶水解產(chǎn)物表現(xiàn)出最強的抗菌活性,且在121 ℃條件處理20 min后仍能保持活性。

    圖1 玉米醇溶蛋白胰蛋白酶(A)和木瓜蛋白酶(B)水解產(chǎn)物DPPH自由基清除能力和E.coli抑菌率Fig.1 DPPH radical scavenging capacity and inhibition percentage against E.coli of trypsin (A) and papain (B) hydrolysates derived from zein

    2.2 玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物的乳化性能

    以EAI為指標,進一步分析了玉米醇溶蛋白兩種蛋白酶水解產(chǎn)物的乳化性能。與未水解蛋白相比,兩種蛋白酶水解產(chǎn)物表現(xiàn)出不同的乳化活性。在整個120 min的消化時間范圍內(nèi),胰蛋白酶水解產(chǎn)物的EAI持續(xù)升高至27.7 m/g,而木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的乳化性能在60 min處即達到穩(wěn)定(EAI為32.8 m/g),繼續(xù)水解并未導致EAI的進一步增加(圖2)。玉米醇溶蛋白經(jīng)適度水解后,其分子質(zhì)量變小,肽鏈分子柔性增加,具有更好的油-水界面吸附能力。Wang Yonghui等報道了玉米醇溶蛋白的堿性蛋白酶水解產(chǎn)物具有兩親性和界面活性。張京京等同樣發(fā)現(xiàn),玉米醇溶蛋白的堿性蛋白酶水解產(chǎn)物較未水解的蛋白乳化性能提高5.36 倍。綜合考慮DPPH自由基清除能力和抑菌率的結(jié)果,選擇玉米醇溶蛋白木瓜蛋白酶水解60 min的產(chǎn)物作為下一步分離分析對象,記為ZPH60。

    圖2 玉米醇溶蛋白胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的EAIFig.2 Emulsifying activity indexes of trypsin and papain hydrolysates derived from zein

    2.3 玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物ZPH60的分離純化結(jié)果

    采用?KTA蛋白純化系統(tǒng)對玉米醇溶蛋白水解物ZPH60進行粗分,其洗脫圖譜如圖3A所示,得到6個主要洗脫峰。收集各洗脫峰組分凍干復(fù)溶并測定DPPH自由基清除率和抑菌率,僅發(fā)現(xiàn)組分2和組分6同時具有抗氧化能力和抗菌活性(圖3B)。其中組分6的DPPH自由基清除率和抑菌率明顯高于組分2。因此,選擇組分6(記為ZPH60-6)經(jīng)反相HPLC再次分離得到10個洗脫組分,收集各部分并測定DPPH自由基清除率和抑菌率(圖4)。其中組分8在0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下表現(xiàn)出46.70%的DPPH自由基清除率,在50 μg/mL質(zhì)量濃度下對具有68.87%的抑菌率。

    圖3 蛋白純化系統(tǒng)分離ZPH60洗脫圖譜(A)及各洗脫峰組分DPPH自由基清除率和E.coli抑菌率(B)Fig.3 Elution profile of ZPH60 separated using ?KTA protein purification system (A) and DPPH radical scavenging capacity and inhibition percentage against E.coli of each elution peak (B)

    圖4 ZPH60-6的HPLC圖譜(A)、各洗脫峰組分的DPPH自由基清除率和E.coli抑菌率(B)以及組分8的HPLC圖譜(C)Fig.4 HPLC profile of ZPH60-6 (A), DPPH radical scavenging capacity and inhibition percentage against E.coli of each elution peak (B)and HPLC profile of active peak 8 (C)

    2.4 玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物ZPH60的氨基酸序列分析結(jié)果

    采用反相HPLC對收集所得組分8進行檢測,結(jié)果如圖4C所示,主峰峰型對稱單一,其純度在96.1%以上,滿足進行質(zhì)譜分析氨基酸序列的要求。在質(zhì)譜分析中,高能場轟擊帶電多肽使其斷裂形成多肽片段離子,得到其二級質(zhì)譜圖(圖5A)。通過氨基酸序列分析得出,該活性峰的氨基酸序列為LLAH(Leu-Leu-Ala-His)(圖5B),使用ExPASy(http://www.expasy.ch/)的omputer pI/Mw預(yù)測軟件分析其理論等電點為6.74,理論分子質(zhì)量為452.55 Da,與測定分子質(zhì)量452.39 Da相符。

    圖5 ZPH60-6-8的質(zhì)譜圖(A)和氨基酸序列分析(B)Fig.5 Mass spectrum (A) and amino acid sequence analysis (B)of ZPH60-6-8

    2.5 玉米醇溶蛋白LLAH的抗氧化、抗菌及乳化能力

    清除自由基能力是評價體外抗氧化活性的常用方法。除DPPH自由基外,ABTS陽離子自由基也是常用的自由基之一。ABTS法是基于ABTS與過硫酸鉀反應(yīng)生成藍綠色陽離子自由基,抗氧化物質(zhì)能與自由基發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色的原理構(gòu)建。還原能力的測定原理是抗氧化活性物質(zhì)可還原鐵氰化鉀中的Fe成為亞鐵氰化鉀的Fe,再進一步和FeCl反應(yīng)生成700 nm波長處有最大吸光度的Fe[Fe(CN)](普魯士藍)。DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的清除率和Δ越大則說明樣品的抗氧化活性越強。表1顯示,通過制備液相色譜收集和化學合成的LLAH具有相近的自由基清除能力和還原能力。LLAH的DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力約為VC的50%,但其鐵離子還原能力與后者相近。之前的研究也證實,玉米黃粉經(jīng)堿性蛋白酶水解后,可獲得氨基酸序列為LDYQ(Leu-Asp-Tyr-Gln)的高純度抗氧化肽。

    表1 玉米醇溶蛋白LLAH的抗氧化能力Table 1 Antioxidant capacity of zein peptide LLAH

    LLAH中的堿性氨基酸組氨酸可能由木瓜蛋白酶選擇性水解堿性氨基酸位點產(chǎn)生,其羧基可同金屬離子螯合,鈍化金屬離子,從而抑制了自由基鏈式。此外,亮氨酸在該肽中占據(jù)了50%的氨基酸比例。在已報道的抗氧化肽中,一定比例的亮氨酸殘基被認為是有益于抗氧化活性的。據(jù)報道,氨基酸序列為LPF(Leu-Pro-Phe)、LLPF(Leu-Leu-Pro-Phe)和 FLPF(Phe-Leu-Pro-Phe)的3種玉米蛋白肽具有DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力,這些肽由玉米粉經(jīng)堿性蛋白酶和風味蛋白酶水解所獲得,肽段氨基酸序列中的Leu殘基被認為與玉米蛋白肽的抗氧化活性有關(guān)。魚皮膠原蛋白抗氧化肽HGPLGPL(His-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Leu)中亮氨酸的比例同樣較高。

    由表2可知,分離所得及化學合成的LLAH對受試革蘭氏陽性細菌(、、)和革蘭氏陰性細菌()的生長均有抑制作用,而Nisin對革蘭氏陰性細菌()未表現(xiàn)出抑制活性。LLAH對不同菌株生長的抑制能力各有不同,其對、、、的MIC分別為8.0、8.0、32.0、16.0 μg/mL;這可能是LLAH對各細菌的抑制機理不同所致。相同質(zhì)量濃度(50.0 μg/mL)下分離純化所得LLAH對各受試菌株的抑制效果均高于化學合成LLAH,這可能是化學合成過程中副反應(yīng)的發(fā)生以及組氨酸的消旋引起的。Kang等發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白的胃蛋白酶水解產(chǎn)物中低于3 000 Da的組分顯示出極大的抗菌活性,并從其中分離出N端序列同樣是亮氨酸的抗菌肽,與本研究中分離所得的N端氨基酸相同,提示玉米醇溶蛋白肽中N端的亮氨酸對抗菌活性有貢獻。

    表2 玉米醇溶蛋白LLAH的抗菌能力Table 2 Antibacterial capacity of zein peptide LLAH

    由表3可知,分離純化所得LLAH及化學合成的LLAH的EAI分別為69.22 m/g和69.53 m/g,與吐溫-80相當。LLAH N端的兩個亮氨酸為疏水性氨基酸,C端組氨酸為親水性氨基酸,因此,該肽的親水性和疏水性氨基酸較為集中,具有較好的兩親性能,可吸附并穩(wěn)定地分布在乳液液滴的水-油界面。

    表3 玉米醇溶蛋白LLAH的乳化能力Table 3 Emulsifying capacity of zein peptide LLAH

    2.6 乳液的粒徑分布及微觀形貌

    表4為LLAH和吐溫-80穩(wěn)定乳液的平均粒徑、Zeta-電位和PDI。兩種乳液的液滴平均粒徑均小于300 nm,Zeta-電位絕對值大于30 mV,且PDI小于0.3。Zeta-電位絕對值大于30 mV可認為乳液液滴之間具有足夠的靜電斥力以維持膠體體系的穩(wěn)定性,這和兩者PDI均小于0.3相互印證。與吐溫-80穩(wěn)定的乳液相比,LLAH穩(wěn)定的乳液液滴粒徑略小,且其PDI較小,表明LLAH具有與吐溫-80相當?shù)娜榛芰?,且分散性更為均一。由圖6可見,吐溫-80穩(wěn)定的乳液具有較大的粒徑分布范圍,且顯微鏡觀察可見,吐溫-80穩(wěn)定的乳液較LLAH穩(wěn)定的乳液表現(xiàn)出更多的液滴聚集。

    表4 LLAH和吐溫-80穩(wěn)定乳液的平均粒徑、Zeta-電位和PDITable 4 Average particle size, zeta potential and polydispersity index(PDI) of LLAH or Tween-80 stabilized emulsion

    圖6 玉米醇溶蛋白肽LLAH及吐溫穩(wěn)定的乳液的粒徑分布及顯微鏡圖Fig.6 Particle size distribution and microscopic image of zein peptide LLAH or Tween-80 stabilized emulsion

    2.7 乳液的穩(wěn)定性

    2.7.1 乳液的貯藏穩(wěn)定性

    圖7A顯示,LLAH及吐溫-80穩(wěn)定的乳液在30 d貯藏期內(nèi)的平均粒徑并無明顯差異,在初始5 d內(nèi),兩者的平均粒徑均無明顯變化,在10 d之后開始隨貯藏時間的延長而緩慢增加。與新鮮制備的乳液相比,LLAH穩(wěn)定的乳液在貯藏30 d之后,平均粒徑由(263.4±3.5)nm增至(313.8±2.4)nm,增幅為19.1%。吐溫-80穩(wěn)定乳液的平均粒徑由(286.8±3.5)nm增加至(338.7±7.9)nm。LLAH表現(xiàn)出較吐溫-80較小的液滴尺寸。Dalgleish等指出,液滴的布朗運動速率與其粒徑呈負相關(guān),小液滴進行快速的布朗運動,可以在長期存儲條件下實現(xiàn)在重力作用下的均勻分布。LLAH穩(wěn)定乳液的較小粒徑表明其可以更好地抵御重力沉降作用。此外,根據(jù)乳液的PDI和Zeta-電位分析,LLAH穩(wěn)定的乳液在30 d內(nèi),PDI和Zeta-電位分別由0.210、-41.87 mV變化至0.227、-39.87 mV;吐溫-80穩(wěn)定乳液的PDI和Zeta-電位則分別由0.289、-35.78 mV變化至0.318、-35.02 mV。更小的尺度多分散特性和較高的Zeta-電位絕對值表明LLAH具有更好的乳液穩(wěn)定效果。通常認為,Zeta-電位絕對值大于30 mV的膠體分散系因具有較大的靜電排斥作用而是穩(wěn)定的,因此,盡管吐溫-80穩(wěn)定乳液具有較高的PDI和較小的Zeta-電位,仍可認為制備的兩種乳液在30 d貯藏期內(nèi)具有較好的貯藏穩(wěn)定性。

    圖7 玉米醇溶蛋白肽LLAH及吐溫-80穩(wěn)定的乳液的貯藏穩(wěn)定性(A)及加速氧化過程中TBARS含量(B)和POV(C)變化Fig.7 Changes in storage stability (A), POV (B) and TBARS content (C)during accelerated oxidation of zein peptide LLAH and Tween-80 stabilized emulsion

    2.7.2 LLAH穩(wěn)定乳液的氧化穩(wěn)定性

    乳液的氧化穩(wěn)定性分別通過POV和TBARS含量來評價脂質(zhì)初級氧化產(chǎn)物和次級氧化產(chǎn)物的生成狀況。初級氧化產(chǎn)物主要由不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生,TBARS主要由脂質(zhì)氫過氧化物分解產(chǎn)生。圖7B、C顯示,新鮮制備的吐溫-80穩(wěn)定乳液中POV和TBARS含量分別為0.63 mg/kg和0.89 mg/kg。加速氧化過程中,吐溫-80穩(wěn)定乳液POV和TBARS含量隨貯藏時間延長呈持續(xù)上升趨勢,在第30天時分別達到6.78 mg/kg和7.32 mg/kg,表明該乳液在貯藏期間經(jīng)歷了脂質(zhì)氧化。與吐溫-80組相比,LLAH穩(wěn)定乳液的POV和TBARS含量在30 d貯藏期間無明顯變化,表現(xiàn)出較緩慢的氧化歷程。這表明LLAH可以減少油相與氧氣之間的相互作用以及降低脂質(zhì)的氧化程度。油-水界面是脂質(zhì)作為分散相和連續(xù)相水相的接觸區(qū)域,乳液中脂質(zhì)氧化主要發(fā)生在油-水界面,因此可以認為,LLAH的抗氧化性能極大地影響了乳液的氧化穩(wěn)定性。LLAH的自由基清除能力和鐵離子還原能力暗示其可以通過發(fā)揮斷鏈型抗氧化劑作用,實現(xiàn)抑制脂質(zhì)氫過氧化物分解成過氧化自由基和烷氧基的反應(yīng),并進一步阻止自由基繼續(xù)作用于不飽和脂肪酸進而生成自由基的反應(yīng)。Shen Yating等同樣基于POV和TBARS含量進行分析研究,發(fā)現(xiàn)玉米粉的中性蛋白酶水解產(chǎn)物能顯著改善乳液的氧化穩(wěn)定性,且乳液脂質(zhì)氧化抑制效果與玉米粉蛋白酶水解產(chǎn)物呈劑量依賴關(guān)系,高濃度的水解產(chǎn)物對乳液脂質(zhì)氧化表現(xiàn)出更有效的抑制作用。

    2.7.3 乳液抗菌性分析結(jié)果

    采用抑菌率來評價乳液的抑菌活性,由表5可見,吐溫-80穩(wěn)定的乳液并未檢測到抑菌活性,而LLAH穩(wěn)定的乳液對4種受試菌株均表現(xiàn)出抑菌效果,表明油-水界面的LLAH仍能在乳液制劑中發(fā)揮抑菌活性。Nielsen和Lou Zaixiang等的研究證實將精油轉(zhuǎn)化成乳液能夠保留其抑菌活性。Moghimi等認為,乳液制劑使得抑菌成分更好地作用于受試菌株的損傷細胞膜中,克服了抑菌成分不能直接作用于細胞膜的缺陷。

    表5 玉米醇溶蛋白肽LLAH及吐溫-80穩(wěn)定的乳液的抑菌率Table 5 Antibacterial capacities of zein peptide LLAH or Tween-80 stabilized emulsion

    3 結(jié) 論

    本實驗采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分別水解玉米醇溶蛋白,比較兩種酶解不同時間酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和對大腸桿菌的抑菌率,選擇高抗氧化和抑菌活性組分作為分離對象,結(jié)合透析、凝膠色譜、反相色譜純化及質(zhì)譜分析,得到了氨基酸序列為LLAH的雙抗活性肽。該肽在0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下具有一定的DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率和鐵離子還原能力,在質(zhì)量濃度為32 μg/mL時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和單增李斯特菌具有抑制活性。經(jīng)該肽穩(wěn)定的乳液平均粒徑為(263.4±3.5)nm,同樣具有抑菌活性、貯藏穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性。本研究結(jié)果為具有雙抗活性的玉米醇溶蛋白肽的分離鑒定及在乳液制劑中的使用提供了理論參考,同時可拓寬玉米醇溶蛋白的高值化加工和利用途徑。

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