女性生殖道內(nèi)β防御素類型與作用

白立恒 宋偉奇 游存厚 楊治理 曹貴方

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018

自然界中，生長在充滿各種環(huán)境中的植物、動(dòng)物等物種都具有一套抵御外界細(xì)菌、病毒等微生物的侵害機(jī)制。在它們的體內(nèi)、體表，都有參與機(jī)體最初防御作用的短肽類活性物質(zhì)，這些物質(zhì)具有很強(qiáng)的防御能力，被稱為抗菌肽（antimicrobial peptides）。在 1965年，Hrish從兔的中性粒細(xì)胞（PMN）中首次提取出1種具有殺菌活性的陽離子蛋白，稱之為“吞噬素”。而后Zeya HI等[1-2]在豚鼠和老鼠的PMN的胞質(zhì)顆粒中同樣發(fā)現(xiàn)了一種陽離子蛋白，富含半胱氨酸和精氨酸，稱為“溶酶體陽離子蛋白”。在20世紀(jì)80年代中期，美國加里福尼亞大學(xué)學(xué)者在研究吞噬細(xì)胞的非依賴氧殺菌機(jī)制過程中，從人和兔中性粒細(xì)胞的胞漿顆粒中發(fā)現(xiàn)一種其一級結(jié)構(gòu)十分相似的一系列小分子陽離子肽，由于這些小分子肽具有廣譜的抗微生物活性[3]，所以首次命名這類肽為御素（defensins）。1989年，法國Hoffmann JA等[4]在昆蟲體內(nèi)分離出一種防御素，與兔肺部內(nèi)吞噬細(xì)胞中防御素分子同源。到目前為止，已在多種生物中發(fā)現(xiàn)了200多種防御素分子[5]，可以說防御素家族是一個(gè)最大的內(nèi)源性抗菌肽家族。

1 β-防御素的發(fā)現(xiàn)、分布、分子特征

1.1 β-防御素的發(fā)現(xiàn)、分布

β-防御素是Diamond G等[6]在牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，之后在牛的中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了13種與其序列高度相似防御素，由于與α-防御素結(jié)構(gòu)不同，故被命名為β-防御素。β-防御素存在于人類的血漿、牛的氣管上皮、中性粒細(xì)胞和骨髓、禽類的白細(xì)胞和人及多種動(dòng)物的舌、牙齦、胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道、皮膚、腎的上皮細(xì)胞中[7-9]。已發(fā)現(xiàn)的人類β-防御素有4種，即HBD-1～HBD-4。HBD-1在腎臟、陰道[10]、胰腺腺泡、唾液腺導(dǎo)管[11]等上皮細(xì)胞及腮腺、下頜腺、齒齦、口腔黏膜、舌中有表達(dá)[12-13]。據(jù)報(bào)道，在人正常的扁桃體內(nèi)也可檢測到HBD-1的存在。而HBD-2是從患牛皮癬患者的皮膚中分離出來的，并且在人類的血漿、唾液、皮膚、以及泌尿生殖道等存在。在上皮組織感染過程中可以被誘導(dǎo)表達(dá)。HBD-3主要在人的呼吸道上皮細(xì)胞和角化細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)[14]，也分布于口腔黏膜、食道、氣管、骨骼肌、心臟、胎盤、和皮膚[15]中。HBD-4在子宮、睪丸、肺、甲狀腺、腎臟感染過程中可被誘導(dǎo)并微量表達(dá)。

1.2 β-防御素分子特征

β-防御素分子內(nèi)有6個(gè)保守的半胱氨酸，并由38～42個(gè)氨基酸組成。β-防御素的保守序列為-------C---GC------C-----QIG-C------CCR-。6個(gè)半胱氨酸殘基配對形成3個(gè)二硫鍵，連接方式為：Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6[14]。β-防御素內(nèi)二硫鍵為了防止蛋白酶的水解可以使小分子防御素緊密聯(lián)結(jié)，所以在富含有蛋白酶的吞噬溶酶體的微環(huán)境中仍可以保持其穩(wěn)定特性，這也是防御素有別于其他抗菌肽的主要特征之一[16]。β-防御素序列中部有一個(gè)保守的脯氨酸和一個(gè)甘氨酸，這是α-防御素所不具有的。β-防御素分子量相對較小，而且具有明顯的半胱氨酸排列的特征，對維持此類分子的三級結(jié)構(gòu)具有重要意義[17-18]。

1.3 β-防御素基因結(jié)構(gòu)分析

β-防御素前原肽分子由64～68個(gè)氨基酸殘基組成，信號(hào)序列和前導(dǎo)序列22～32個(gè)氨基酸殘基。β-防御素基因含有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，第1個(gè)外顯子編碼5′端非翻譯區(qū)及前體肽功能團(tuán)，第2個(gè)外顯子編碼3′端非翻譯區(qū)和成熟肽（圖1）。在人β-防御素中，HBD-1中有一個(gè)內(nèi)含子和兩個(gè)相對較小的外顯子，第一個(gè)外顯子編碼信號(hào)肽和前原片段，第二個(gè)則編碼成熟肽。HBD-2中也為一個(gè)內(nèi)含子和兩個(gè)外顯子，第一個(gè)外顯子編碼信號(hào)肽，另一個(gè)編碼成熟肽和原片段。HBD-3的基因位于與其同向轉(zhuǎn)錄的HBD-2的基因上游約13 kb處，已有兩個(gè)外顯子：一個(gè)約4.5 kb的內(nèi)含子將HBD-4基因的兩個(gè)外顯子分隔，一個(gè)外顯子編碼大部分信號(hào)肽序列，信號(hào)肽的剩余部分加原片段和成熟肽則由另一個(gè)外顯子所編碼。TAP也是一種β-防御素，基因結(jié)構(gòu)分析顯示有兩個(gè)外顯子，有一個(gè)116 kb的內(nèi)含子在插在兩個(gè)外顯子之間，其中外顯子1編碼其前體分子的信號(hào)序列和部分前區(qū)序列，外顯子2編碼部分前區(qū)序列和整個(gè)成熟肽序列。

圖1 β-防御素cDNA序列示意圖Fig.1 The cDNA of β-defensins

β-防御素的表達(dá)形式既有組成型的，又有誘導(dǎo)型的。在人的4種β-防御素中，β-防御素1在上皮細(xì)胞中為組成型表達(dá)，另外三種β-防御素除組成型的基礎(chǔ)表達(dá)外，還能夠被誘導(dǎo)表達(dá)。例如：β-防御素2的表達(dá)可以被TNF-α、LPS、IL-1β及細(xì)菌等多種原炎劑所誘導(dǎo)；β-防御素3的表達(dá)可被 IL-1β、IFNγ、TNF-α 及細(xì)菌所誘導(dǎo)；β-防御素 4的表達(dá)可被豆蔻酰佛波醇乙酯所誘導(dǎo)。

2 人女性生殖道內(nèi)β-防御素

近年來，眾多研究結(jié)果表明，在女性生殖道內(nèi)廣泛分布著人防御素，與女性天然免疫的防御機(jī)制有密切關(guān)系。對保證女性生殖系統(tǒng)在正常狀態(tài)下維持生殖健康，抵抗各種外源病菌感染起重要的作用。正常情況下，女性陰道內(nèi)存在多種微生物，這些微生物維持生殖道生理狀態(tài)而不致發(fā)生感染，除了宮頸黏液栓屏障、陰道酸堿度等自凈作用外，子宮內(nèi)膜、宮頸、陰道廣泛分布的防御素也同樣起到重要作用。

2.1 女性生殖道內(nèi)人β-防御素存在位置

Valore EV等[19]研究證實(shí)，HBD-1在輸卵管子、宮內(nèi)膜、宮頸、陰道及泌尿系統(tǒng)的腎臟、尿道等均有表達(dá)，對大腸埃希菌等微生物均有殺滅作用，提出HBD-1是女性泌尿生殖道重要的先天免疫防御因子，對泌尿生殖道局部抗菌防御起重要作用。King AE等[20]研究結(jié)果表明，不同的β-防御素在女性生殖道不同狀態(tài)下表達(dá)不同。在子宮內(nèi)膜和內(nèi)膜細(xì)胞株，HBD-1呈低水平表達(dá)；在分泌期的內(nèi)膜，HBD-3表達(dá)水平最高；在增生期內(nèi)膜，HBD-4表達(dá)水平最高，而HBD-2呈高水平表達(dá)。Grable IA等[21]研究結(jié)果同樣證明，子宮內(nèi)膜中HBD-1~4都有表達(dá)。Fleming DC等[22]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜中，HBD-1、HBD-2不同周期中變化不一，在分泌中期的子宮內(nèi)膜中HBD-1表達(dá)水平最高；在月經(jīng)期的子宮內(nèi)膜中HBD-2表達(dá)水平最高。采用定量PCR和免疫組化方法，進(jìn)一步研究避孕方法、避孕藥對女性生殖道人防御素表達(dá)的影響，結(jié)果表明，未避孕、口服避孕藥、放置左旋諾孕酮（levonorgestrel）宮內(nèi)節(jié)育器的婦女，HBD-1、HBD-2在子宮內(nèi)膜的都有表達(dá)，使用口服避孕藥、放置左旋諾孕酮宮內(nèi)節(jié)孕器，HBD-1、HBD-2的表達(dá)水平均呈下降趨勢，提出甾體類激素可以影響HBD-1，HBD-2在子宮內(nèi)膜的基因轉(zhuǎn)錄。在體外實(shí)驗(yàn)中，Pivarcsi DC等也同樣發(fā)現(xiàn)，結(jié)合型口服避孕藥可調(diào)控HBD-3、HBD-4的表達(dá)水平。馮艷等[23]研究了人HBD-2防御素基因在女性生殖道及妊娠相關(guān)組織中的表達(dá)狀況，結(jié)果證明，正常女性卵巢、輸卵管、子宮內(nèi)膜、子宮頸、陰道5種組織中都有HBD-1 mRNA水平的表達(dá)。除卵巢、陰道外，其余3種組織中也都有HBD-2 mRNA的表達(dá)，臍帶、胎盤、羊膜、絨毛膜、絨毛5種妊娠相關(guān)組織中，除羊膜外，HBD-1 mRNA在各組織中均有表達(dá)，而在絨毛膜、絨毛及胎盤組織中，HBD-2 mRNA有表達(dá)。Svinarich報(bào)道，用RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，人的子宮內(nèi)膜、宮頸內(nèi)膜和絨毛膜細(xì)胞株在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)HD5，因而認(rèn)為防御素是女性生殖器官抗感染的機(jī)制之一。由此看來，人防御素HBD-1~4在女性生殖道的輸卵管、子宮、子宮頸、引導(dǎo)各段的表達(dá)都存在。

2.2 人β防御在生殖道中存在的意義與作用

β防御具有多種功效，在生殖道感染、免疫、胎兒正常發(fā)育等具有重要作用。

2.2.1 β防御的抗菌、抗病毒等作用 Akinbi等研究結(jié)果證實(shí)，羊水、胎膜中含有HBD-2，并具有抗真菌、細(xì)菌的活性。Valore等研究結(jié)果同樣證實(shí)，HBD-1在女性生殖道廣泛存在，甚至在尿中也存在HBD-1，具有殺滅大腸埃希菌的作用。Buhimschi等在培養(yǎng)的羊膜上皮細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)了HBD-1~4，其中HBD-3表達(dá)水平最高。進(jìn)一步研究證明羊膜細(xì)胞HBD-1~4的表達(dá)水平可以被微生物所誘導(dǎo)上調(diào)。提出了防御素在保護(hù)胎兒的防御機(jī)制中有重要作用的論點(diǎn)。King等研究結(jié)果也證實(shí)在胎盤中有HBD-3表達(dá)，IL-1可誘導(dǎo)胎盤中有HBD-3的表達(dá)。Grable IA等[21]研究了正常孕婦、胎膜早破孕婦人防御素水平差異，結(jié)果極顯著（正常孕婦668 ng/mL，胎膜早破孕婦 5665 ng/mL，P<0.01），無絨毛膜炎與有絨毛膜炎相比較，差異也同樣顯著（無絨毛膜炎孕婦520 ng/mL，有絨毛膜炎孕婦9163 ng/mL，P<0.01）。呂曉杰等[24]研究認(rèn)為，人HBD-1在健康婦女、生殖道感染婦女的生殖道中都有較弱表達(dá)，表達(dá)量與感染無關(guān)，而HBD-2則廣泛表達(dá)，表達(dá)量和生殖道感染密切相關(guān)。由此看來，β防御與抗感染有一定關(guān)系。

2.2.2 β防御的免疫作用 研究表明，HBD-2在天然免疫和獲得免疫中均起著重要的作用，在正常子宮內(nèi)膜組織中，可能在維系正常生殖道的黏膜防御中起著重要的作用。陳淑琴等[25]研究了子宮內(nèi)膜異位癥患者在位和異位內(nèi)膜組織中人β防御素-2的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)，異位內(nèi)膜組內(nèi)膜組織中HBD-2的基因表達(dá)水平顯著高于在位內(nèi)膜組和對照組。在位內(nèi)膜組和對照組子宮內(nèi)膜組織中HBD-2的基因表達(dá)水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。異位內(nèi)膜組中，HBD-2臨床分期表達(dá)為Ⅰ期高于Ⅲ期和Ⅳ期、Ⅱ期高于Ⅲ期和Ⅳ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測，異位內(nèi)膜組織中HBD-2的高表達(dá)可能參與了內(nèi)異癥的發(fā)病。HBD-2通過CCR6受體，吸引記憶性T細(xì)胞、不成熟樹突狀細(xì)胞進(jìn)入到炎癥部位，進(jìn)而活化細(xì)胞免疫、體液免疫系統(tǒng)，最終殺死、清除病菌。Brogden KA等發(fā)現(xiàn)HBD-2能夠促進(jìn)相關(guān)細(xì)IL-12、IFN-γ等抗病毒免疫因子，同時(shí)激助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），此外，HHNP-1還能夠提高小鼠體內(nèi)的IgG水平[26]。

2.3 生殖道內(nèi)β防御素的調(diào)控

生殖道內(nèi)的β防御表達(dá)除受到一些細(xì)菌成分，如LPS影響外，還可能受到藥物、激素等影響。

2.3.1 LPS等細(xì)菌成分、細(xì)胞因子等對β防御素的誘導(dǎo)作用 研究表明，脂多糖（LPS）具有促進(jìn)上皮細(xì)胞β防御表達(dá)作用。King AE等[20]研究證實(shí)，炎性介質(zhì)如TNF-α、ITF-γ、IL-1等可使子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞株中HBD-2 mRNA表達(dá)水平有增加的趨勢，證實(shí)LPS、LTA能誘導(dǎo)人防御素的表達(dá)。在以上因子的參與下，原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞中HBD-3表達(dá)水平上調(diào)，對HBD-4表達(dá)無影響。此外，PGN、滅活的白色念珠菌、酵母多糖等刺激，均可上調(diào)陰道上皮細(xì)胞中HBD-2的表達(dá)水平。粘病毒抗性基因1可分別上調(diào)HBD-1和HBD-2的表達(dá)水平6和4倍。上述研究結(jié)果表明，存在于女性生殖道的防御素等的天然防御分子，在感染過程中能被細(xì)胞因子及免疫調(diào)節(jié)因子大量誘導(dǎo)上調(diào)，參與抗微生物活動(dòng)。

2.3.2 藥物、激素等對生殖道內(nèi)β防御素表達(dá)影響 Han等[17]研究報(bào)道，更年期雌激素缺乏或口服孕激素類避孕藥的女性可能會(huì)影響陰道上皮細(xì)胞生產(chǎn)HBD-2。Fleming DC等[22]研究避孕藥、甾體類激素能夠影響人防御素1~2在子宮內(nèi)膜的基因轉(zhuǎn)錄。Pivarcsi等證明體外實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合型口服避孕藥可上調(diào)影響防御素3~4的表達(dá)水平。Wen Shiyong等[27]研究動(dòng)物（綿羊）的輸卵管、子宮、陰道的綿羊防御素受到孕激素、雌激素的促進(jìn)作用是通過其受體來實(shí)現(xiàn)的。由此說明，藥物、激素等對生殖道內(nèi)β防御素表達(dá)都有影響。

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