幽門螺桿菌陽性萎縮性胃炎大鼠生物信息分析及安胃湯影響的研究

徐杉 周瑞東 龔純 蒙毅 張帆 鄭景輝 唐友明 朱永蘋

摘要 目的：基于生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)篩選幽門螺桿菌（Hp）相關(guān)性慢性萎縮性胃炎的關(guān)鍵基因，探索其發(fā)病機(jī)制及安胃湯對(duì)其的影響。方法：從數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus（GEO）下載Hp相關(guān)性慢性萎縮性胃炎相關(guān)芯片數(shù)據(jù)，利用GEO2R軟件篩選出Hp相關(guān)性慢性萎縮性胃炎差異基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)蛋白參與通路數(shù)量確定核心蛋白，建立Hp陽性慢性萎縮性胃炎大鼠模型，用PCR和蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）進(jìn)行檢測(cè)并觀察安胃湯對(duì)其表達(dá)的影響。結(jié)果：經(jīng)過檢索分析GSE13873和GSE27411系列芯片數(shù)據(jù)被納入，取2個(gè)芯片交集的20個(gè)差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A1、CD36、囊性纖維化穿膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（CFTR）可能是信號(hào)通路的核心蛋白。Western Blotting及PCR結(jié)果顯示Hp相關(guān)性慢性萎縮性胃炎大鼠胃組織中，CD36蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05），載脂蛋白A1和CFTR蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05）;與模型組比較，實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組、實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組和實(shí)驗(yàn)觀察低劑量組胃組織中CD36蛋白表達(dá)上調(diào)，載脂蛋白A1和CFTR表達(dá)下調(diào)（P<0.05），其與Hp相關(guān)性慢性萎縮性胃炎發(fā)病關(guān)系密切。結(jié)論：通過對(duì)GEO中Hp相關(guān)性慢性萎縮性胃炎芯片生物信息學(xué)分析結(jié)合Western Blotting及PCR進(jìn)一步的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A1、CD36、CFTR作為信號(hào)通路的核心蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞 慢性萎縮性胃炎;幽門螺旋桿菌;生物信息學(xué);基因芯片;安胃湯;載脂蛋白A1;CD36;囊性纖維化穿膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白

Bioinformatics Analysis of Helicobacter pylori-Positive Rats with Atrophic Gastritis and the Effect of Anwei Decoction

XU Shan1，2，ZHOU Ruidong1，GONG Chun1，MENG Yi1，ZHANG Fan1，ZHENG Jinghui1，TANG Youming3，ZHU Yongping3

（1 Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China; 2 Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hubei Public Security University， Jingzhou 434300，China; 3 Department of Gastroenterology，Ruikang Hospital，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530011，China）

Abstract Objective：To screen key genes of Helicobacter pylori（Hp）-related chronic atrophic gastritis based on biomedical big data and explore its pathogenesis and the influence of Anwei Decoction.Methods：The chip data of Hp-related chronic atrophic gastritis were downloaded from Gene Expression Omnibus（GEO），and the differential genes of HP-related chronic atrophic gastritis were screened out by GEO2R.Bioinformatics analysis was conducted，and the core proteins were determined according to the number of protein-participating pathways.The Hp（+） chronic atrophic gastritis model was induced in rats.PCR and Western blot were used to detect the effect of Anwei Decoction on the expression.Results：After retrieval and analysis of GSE13873 and GSE27411 series chip data，20 common differential genes of the two chips were taken for bioinformatics analysis，and the results showed that apolipoprotein A1（APOA1），CD36，and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（CFTR） might be the core proteins of the signaling pathway.Western blot and PCR results showed that the expression of CD36 protein was down-regulated（P<0.05），and the expression of APOA1 and CFTR was up-regulated（P<0.05） in the gastric tissues of rats with HP-related chronic atrophic gastritis.Compared with the model group，the high-，medium-and low-dose Anwei Decoction groups showed up-regulated expression of CD36 and down-regulated expression of APOA1 and CFTR（P<0.05），which was closely related to the incidence of HP-related chronic atrophic gastritis.Conclusion：As revealed by the bioinformatics analysis of HP-related chronic atrophic gastritis in GEO microarray and verification by Western blot and PCR，the experimental results of APOA1，CD36，and CFTR as the core proteins of the signaling pathway were consistent with the results of bioinformatics analysis.

Keywords Chronic atrophic gastritis; Helicobacter pylori; Bioinformatics; Gene chip; Anwei Decoction; APOA1; CD36; Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

中圖分類號(hào)：R256;R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.10.006

慢性萎縮性胃炎（Chronic Atrophic Gastritis，CAG）是由于胃黏膜萎縮變薄，胃腺體減少，導(dǎo)致胃酸及胃蛋白酶分泌減少的慢性病變[1]。近年的研究數(shù)據(jù)顯示，全球大多數(shù)國家幽門螺旋桿菌（Helicobacter Pylori，Hp）感染率仍較高，約有33%成年人存在Hp感染[2]。由中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化內(nèi)鏡學(xué)分會(huì)進(jìn)行的一項(xiàng)橫斷面調(diào)查顯示，CAG是我國最常見的一種慢性胃炎[3]。CAG病因與吸煙、酗酒、藥物及Hp感染等因素有關(guān)，Hp是主要危險(xiǎn)因素，可促進(jìn)CAG患者胃黏膜癌變[4]。根除Hp可減少胃黏膜炎癥、組織學(xué)損害的進(jìn)展、消化性潰瘍的復(fù)發(fā)，以及患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)[5]。安胃湯為全國名老中醫(yī)林沛湘教授的經(jīng)驗(yàn)方，寒熱并用，活血行氣，暢通氣機(jī)，治療慢性胃潰瘍療效確切[6-7]。本研究利用高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中的基因芯片數(shù)據(jù)對(duì)，挖掘Hp感染CAG芯片數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了分子生物學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)資料來源 生物信息學(xué)資料來源從GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫中檢索所有與Hp陽性相關(guān)的CAG芯片數(shù)據(jù)。物種限定為哺乳動(dòng)物，同時(shí)分組中含有Hp陽性的CAG與Hp陽性正常胃黏膜進(jìn)行比較的表達(dá)譜的數(shù)據(jù)系列。

1.1.2 動(dòng)物 SD雄性大鼠，4周齡，體質(zhì)量（100±20）g，72只，無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)，購于湖南萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)施地點(diǎn)在廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)（SYXK桂2019-0001）。分籠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境為室溫18～25 ℃、相對(duì)濕度50%～60%、人工12 h晝/夜循環(huán)照明。隔日更換墊料、清洗籠舍，大鼠自由攝食及飲水。動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：DW20190310-045）。

1.1.3 Hp菌株 采用悉尼標(biāo)準(zhǔn)菌株（SSI），含有細(xì)胞毒素相關(guān)基因（CagA+）和空泡細(xì)胞毒素（VavA+）（美國MTCC公司，美國，菌株編號(hào)：ATCC43504）。將Hp接種于瓊脂培養(yǎng)基（OXOID公司，美國，貨號(hào)：CM0331），配成650 mL培養(yǎng)液，加30 mL脫纖維羊血，高壓滅菌，在微需氧的環(huán)境（二氧化碳體積分?jǐn)?shù)0.10，氧氣體積分?jǐn)?shù)0.05，氮?dú)怏w積分?jǐn)?shù)0.85）下37 ℃培養(yǎng)3 d備用。

1.1.4 藥物 安胃湯：半夏13 g、黃連5 g、干姜5 g、烏藥7 g、丹參15 g、百合20 g、白芍20 g、薏苡仁10 g、炙甘草5 g，飲片購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院門診中藥房。將以上藥物飲片煎汁至1 g/mL備用，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[8]中人和動(dòng)物體表面積比值劑量表，給藥劑量按照體質(zhì)量60 kg成人劑量的6.17倍計(jì)算為10.3 g/kg，作為中劑量，以正常劑量的0.5倍及2倍作為安胃湯低、高劑量，按以上3種劑量對(duì)濾液進(jìn)行劑量調(diào)整。阿莫西林250 mg/粒（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司，批號(hào)：9C050103），甲硝唑200 mg/片[遠(yuǎn)大醫(yī)藥（中國）有限公司，批號(hào)：190322]，吲哚美辛25 mg/粒（山西云鵬制藥有限公司，批號(hào)：D190101），碳酸氫鈉片[上海玉瑞生物科技（安陽）有限公司，批號(hào)：181111]，脫氧膽酸鈉（北京索萊寶生物有限公司，貨號(hào)：SLBZ6975），氨水（成都市科龍化工試劑廠，貨號(hào)：2016040501）。

1.1.5 試劑與儀器 兔抗CD36抗體（abcam公司，英國，批號(hào)：GR243753-3）;兔抗載脂蛋白A1抗體（abcam公司，英國，批號(hào)：GR3253377-4）;兔抗囊性纖維化穿膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator，CFTR）抗體（abcam公司，英國，批號(hào)：GR3208838-1）;兔抗GAPDH抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：00078427）;特超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：7E341E9）;BCA蛋白定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：14G08A460）;SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：7E092H6）、RT Super Mix for qPCR（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：7E020C6）、RNA-easy TM Isolation Reagent（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：7E303H9）均購自南京諾唯贊生物科技有限公司;胃幽門螺桿菌快速檢測(cè)試紙（廣州貝思奇診斷試劑有限公司，批號(hào)：201904136）。全波長多功能酶標(biāo)儀（Tecan公司，瑞士，型號(hào)：Infinite M200 PRO）;水平、垂直電泳、轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad公司，美國，型號(hào)：PROTEANi12IEF）;Bio-RadImage-Lab凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號(hào)：Chemidoc CD touch）;熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士，型號(hào)：羅氏Light cycler 96）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 通過GEO2R分析系統(tǒng)分析不同組織中基因的差異表達(dá)，通過在線交集分析軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）薈萃查找相關(guān)3個(gè)芯片中相互共有的差異基因，通過David（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析，通過STRING10.0（http：//www.string-db.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析[9]。

1.2.2 分組與模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，正常對(duì)照組10只，造模組50只。參照唐旭東等[10]模型制備方法，予以2%阿莫西林+2.5%甲硝唑混合液灌胃3 d，6.6 mL/kg，1次/d;再以2%吲哚美辛溶液灌胃2 d，3.3 mL/kg，1次/d;最后以20%碳酸氫鈉溶液灌胃，6.6 mL/kg，15 min后灌胃Hp菌懸液1 mL/次，濃度1×1012CFU/L，隔日1次，共6次。灌胃前后禁食12 h及4 h;Hp種植完成后正常飼養(yǎng)28 d再給予0.83%脫氧膽酸鈉和0.05%氨水代替飲用水交替飲用，饑飽失常飲食，持續(xù)8周。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：蘇木精-伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色病理檢測(cè)大鼠胃黏膜固有層腺體減少并萎縮，快速尿素酶試驗(yàn)檢測(cè)Hp陽性提示造模成功。造模成功后對(duì)造模大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組、實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組、實(shí)驗(yàn)觀察低劑量組、模型對(duì)照組、陰性對(duì)照組，每組10只。

1.2.3 干預(yù)方法 實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組（安胃湯濃度20.6 g/kg）、實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組（安胃湯濃度10.3 g/kg）、實(shí)驗(yàn)觀察低劑量組（安胃湯濃度5.15 g/kg）、模型對(duì)照組（常規(guī)飼養(yǎng)）、陰性對(duì)照組（等量生理鹽水）共5組。灌胃干預(yù)4周，干預(yù)結(jié)束后予以麻醉處死取材。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1）快速尿素酶法檢測(cè)Hp感染：將造模大鼠胃黏膜組織放入快速尿素酶檢測(cè)的反應(yīng)區(qū)域，以及大鼠胃黏膜組織細(xì)菌培養(yǎng)72 h，再行同樣方法檢測(cè)，5 min內(nèi)觀察反應(yīng)區(qū)域顏色變化情況，試劑顏色由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色說明檢測(cè)結(jié)果為陽性，提示Hp感染。2）蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測(cè)大鼠胃黏膜組織相關(guān)蛋白的表達(dá)：取沖洗后胃組織50 mg，加入RIPA（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑），冰上研磨30 min，4 ℃、12 000×g離心15 min。取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將各組濃度調(diào)至一致，加入上樣緩沖液，100 ℃變性5 min。電泳（80 V，20 min，120 V，45 min），轉(zhuǎn)膜（4 ℃，300 MA恒流，60 min），5%BSA室溫封閉15 min，加入一抗CD36（1∶5 000）、CFTR（1∶5 000）、載脂蛋白A1（1∶5 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗IgG（1∶10 000），室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色，Bio-RadImage-Lab凝膠成像分析系統(tǒng)成像拍照，采用Image J軟件進(jìn)行分析。3）實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time quantitative PCR）法檢測(cè)大鼠胃黏膜組織相關(guān)mRNA的表達(dá)：使用RNA-easy TM Isolation Reagent試劑盒提取胃組織Total RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA含量及純度。每組計(jì)算1 μgRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。稀釋后取5 μLcDNA進(jìn)行Real-time quantitative PCR，以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)體系20 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 120 s;95 ℃ 15 s 55 ℃ 15 s 72 ℃ 60 s;95 ℃ 15 s 60 ℃ 60 s 95 ℃ 15 s;37 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。計(jì)算Ct值，以2-△△Ct計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism軟件進(jìn)行處理與分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 芯片數(shù)據(jù)基本信息 檢索發(fā)現(xiàn)GEO數(shù)據(jù)庫中有19個(gè)系列與CAG相關(guān)，經(jīng)篩選分析，有2個(gè)系列符合納入要求，分別是GSE27411和GSE13873，其中GSE27411又分為胃竇組織和胃體黏膜兩部分2組數(shù)據(jù)集分別有20 589個(gè)、45 101個(gè)有效基因探針。見表1。

2.1.2 分析的差異基因 結(jié)合2個(gè)GEO數(shù)據(jù)庫芯片序列的2個(gè)系列的3組數(shù)據(jù)運(yùn)用GEO2R分析系統(tǒng)，分析了基因在不同組織中的差異表達(dá)，GSE27411共篩選出2 981個(gè)差異基因，其中1 316個(gè)上調(diào)基因、1 665個(gè)下調(diào)基因;GSE13873共篩選出2 435個(gè)差異基因，其中1 002個(gè)上調(diào)基因、1 433個(gè)下調(diào)基因。并對(duì)3組數(shù)據(jù)進(jìn)行了薈萃分析查找相互交集的差異基因，最終篩選到20個(gè)候選基因，其中3組芯片共表達(dá)的差異基因3個(gè)：APOA1、CLCA1和GPA33;芯片GSE27411（胃竇組織）和芯片GSE1387共表達(dá)差異基因有12個(gè)：AQP4、ATP4B、CFTR、CKB、CLDN2、CLDN7、CLPS、CD37、GAST、KCNE2、LPL、REG3G。芯片GSE27411（胃體黏膜）和芯片GSE13873共表達(dá)差異基因有5個(gè)：C3、CD36、CXCL13、LTF、UBD。見表2，圖1～2。

2.1.3 差異基因GO富集分析

2.1.3.1 差異蛋白基因生物過程（Biological Processes，BP）分析 對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的20種差異表達(dá)蛋白基因進(jìn)行BP分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要參與9種生物學(xué)過程，生物過程分析差異蛋白主要涉及膽固醇內(nèi)流、三酰甘油分解代謝過程、免疫應(yīng)答、膽固醇生物合成過程、磷脂代謝過程等。見表3。

2.1.3.2 差異蛋白基因細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）分析 對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的20種差異表達(dá)蛋白基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白包含了5種細(xì)胞組分，均是細(xì)胞外區(qū)域或空間及脂蛋白成分。見表4。

2.1.3.3 差異蛋白基因分子功能（Molecular Function，MF）分析 對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的20種差異表達(dá)蛋白進(jìn)行MF分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白參與了2類分子途徑，分別是肝素結(jié)合、受體結(jié)合。見表5。

2.1.4 差異基因KEGG通路分析 結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異“關(guān)鍵基因”主要分布在8條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上。見表6。這些通路主要是和細(xì)胞的增殖、分化及胃酸、膽汁、胰腺的分泌，脂肪的消化和吸收有關(guān)。其中CD36基因分布在5條通路上，分別為脂肪的消化和吸收、PPAR通路、AMPK通路、吞噬體、造血細(xì)胞譜系。CFTR基因分布在4條通路上，分別為胃酸、胰液、膽汁的分泌、AMPK通路。載脂蛋白A1分布在2條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，分別為脂肪消化吸收和PPAR通路。見表6，圖3。以上3個(gè)因子參與通路數(shù)量最多，故確定其為病理環(huán)節(jié)重要的“關(guān)鍵基因”。對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析發(fā)現(xiàn)PPAR通路和AMPK通路在細(xì)胞的分化中具有重要作用，故確定為主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這些基因和通路，在幽門螺旋桿菌感染導(dǎo)致CAG發(fā)病的過程中彼此有協(xié)同作用，都得到分子生物學(xué)驗(yàn)證。

2.1.5 差異PPI網(wǎng)絡(luò)分析 交集后的20個(gè)差異基因共涉及20個(gè)節(jié)點(diǎn)，10條邊。其中載脂蛋白A1、CD36、CFTR存在相互作用關(guān)系，并為PPI網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)。見圖4。

2.2 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 Hp相關(guān)性CAG模型制備情況 快速尿素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示：造模組大鼠胃黏膜細(xì)菌培養(yǎng)后檢測(cè)及直接檢測(cè)試劑由黃色變?yōu)榧t色，說明試驗(yàn)結(jié)果為陽性，提示Hp感染成功。見圖5。病理檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模組大鼠胃黏膜組織可見中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，固有腺體部分減少并萎縮，符合CAG的表現(xiàn)。見圖6。

2.2.2 載脂蛋白A1、CD36、CFTRmRNA在CAG大鼠胃組織中的表達(dá) 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果中顯示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組CD36表達(dá)下調(diào)（P<0.05），載脂蛋白A1和CFTR表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。CD36和陰性對(duì)照組比較，在實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組、實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組和實(shí)驗(yàn)觀察低劑量組胃組織中表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。載脂蛋白A1和陰性對(duì)照組比較，在實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組、實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組和實(shí)驗(yàn)觀察低劑量組表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。與實(shí)驗(yàn)觀察低劑量組比較，實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。CFTR和陰性對(duì)照組比較，在實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組、實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組和實(shí)驗(yàn)觀察低劑量組表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。見圖7。

2.2.3 載脂蛋白A1、CD36、CFTR蛋白在CAG大鼠胃組織中的表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組CD36表達(dá)下調(diào)（P<0.05），載脂蛋白A1和CFTR表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。CD36和陰性對(duì)照組比較，在實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組、實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組胃組織中表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。與實(shí)驗(yàn)觀察低劑量組比較，實(shí)驗(yàn)觀察高、中劑量組表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。載脂蛋白A1和陰性對(duì)照組比較，在實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組、實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組和實(shí)驗(yàn)觀察低劑量組表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。與實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組比較，實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。CFTR和陰性對(duì)照組比較，在實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組、實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組和實(shí)驗(yàn)觀察低劑量組表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。與實(shí)驗(yàn)觀察中劑量組比較，實(shí)驗(yàn)觀察高劑量組表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。見圖8。

3 討論

CAG疾病常常反復(fù)發(fā)作，遷延難愈，在中醫(yī)學(xué)中屬于“胃脘痛”“痞證”等范疇，與肝脾密切有關(guān)[11]。安胃湯是已故名老中醫(yī)林沛湘教授長期治療慢性胃病總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方。由《傷寒論》中“半夏瀉心湯”加減而來，制定了“順五臟、安胃腑”的治療方法。本方中以制半夏為君藥，具有“燥胃濕，益脾胃氣，散結(jié)”之用;《傷寒論》中半夏用量為半升，參照仝小林等[12]研究中的換算單位約為48 g，在治療萎縮性胃炎時(shí)臨床常用劑量為10～15 g[13]，故本方中半夏的用量為13 g。白芍柔肝健脾止痛，配以烏藥疏肝解郁止痛，薏苡仁健脾除濕;少佐黃連瀉火解毒，干姜溫中逐寒，寒熱同施，辛開苦降;丹參;涼血祛瘀，配合百合、炙甘草，則養(yǎng)津護(hù)胃，酸甘化陰以生津液。本方組方嚴(yán)謹(jǐn)，疏肝理脾，平調(diào)寒熱，祛濕化瘀，主治寒熱錯(cuò)雜、痰瘀內(nèi)結(jié)之證。方中半夏具有抑制胃酸分泌、止吐、抗消化性潰瘍、保護(hù)胃黏膜的現(xiàn)代藥理學(xué)作用[14];丹參為調(diào)理血分要藥，具有“一味丹參，功同四物”的美譽(yù)，周慶華和王紅梅[15]研究顯示丹參能夠通過抑制胃酸分泌對(duì)胃黏膜損傷具有保護(hù)作用。臨床研究都證實(shí)安胃湯加味治療CAG具有較好的臨床療效，能有效改善患者的中醫(yī)證候[16-17]。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，安胃湯干預(yù)治療能有效改善CAG，能夠改善CD36、CFTR、載脂蛋白A1在CAG胃組織中的表達(dá)。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫究篩選得到CAG差異表達(dá)的基因有20個(gè)，在對(duì)這20個(gè)差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析過程中發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)的基因參與了多個(gè)生物過程，主要分布在8條信號(hào)通路上，根據(jù)參與通路的多少確定CD36、CFTR、載脂蛋白A1為CAG疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)目前未見有人對(duì)其進(jìn)行相關(guān)研究報(bào)道，故本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)其驗(yàn)證，探索其發(fā)病機(jī)制及安胃湯對(duì)其的影響，為CAG治療提供新的思路。

CD36作為B類清道夫受體，在脂質(zhì)攝取、免疫學(xué)識(shí)別、炎癥、分子黏附和細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，它廣泛存在于血小板、單核細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞中，通過與多種配體相結(jié)合，從而介導(dǎo)先天性免疫和炎癥等不同的生物過程。本研究預(yù)測(cè)出CD36主要存在于脂肪的消化吸收、PPAR信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、吞噬體中。Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn)AMP活化蛋白激酶可通過上調(diào)CD36的表達(dá)，促進(jìn)胃腸道長鏈脂肪酸的攝取，而細(xì)胞長鏈脂肪酸攝取是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵生理過程。Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞中氧化的LDL/CD36信號(hào)將脂肪酸代謝失調(diào)與線粒體的氧化應(yīng)激聯(lián)系在一起，從而驅(qū)動(dòng)慢性炎癥。Farokhzadian等[20]也發(fā)現(xiàn)S100A12-CD36通過與晚期糖基化終產(chǎn)物和Toll樣受體4結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞和免疫途徑改變炎癥。過氧化物酶體增殖物激活受體γ也被認(rèn)為是調(diào)控CD36表達(dá)的關(guān)鍵因子，F(xiàn)ebbraio等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在過氧化物酶體增殖物激活受體γ缺失的細(xì)胞中，CD36的表達(dá)相應(yīng)下調(diào)。CD36在脂肪酸代謝活躍的組織中具有很高的表達(dá)量，例如心臟、脂肪、小腸及肌肉組織等，而在無利用脂肪酸能力的肝細(xì)胞中表達(dá)極低[22]。王毅群等[23]研究顯示胞質(zhì)內(nèi)的CD36轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸的能力與AMPK信號(hào)通路有關(guān)。本研究顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胃組織中CD36的表達(dá)下調(diào)，并具有顯著性差異。本研究的預(yù)測(cè)結(jié)果和試驗(yàn)結(jié)果均提示，CD36可能為CAG的關(guān)鍵靶點(diǎn)。與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)觀察組（安胃湯干預(yù)組）高、中、低劑量組中胃組織CD36蛋白表達(dá)上調(diào)，并具有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，安胃湯能通過對(duì)CD36的調(diào)節(jié)改善CAG，其機(jī)制可能與CD36調(diào)節(jié)脂肪的消化吸收、PPAR信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路有關(guān)。

CFTR是一種囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子，屬于ATP門控性氯離子通道，表達(dá)于氣道、消化道及生殖道上皮細(xì)胞頂部質(zhì)膜中，主要功能是參與膜內(nèi)外氯離子運(yùn)輸，可影響消化道、呼吸道等上皮功能[24]。本研究預(yù)測(cè)出CFTR是CAG的關(guān)鍵靶標(biāo)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胃組織中CFTR上調(diào)，與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)觀察組（安胃湯干預(yù)組）高、中、低劑量組中胃組織CFTR蛋白表達(dá)下調(diào)，并具有顯著性差異。本研究預(yù)測(cè)出CFTR在CAG中的表達(dá)主要與胃酸分泌物、AMPK信號(hào)通路、膽汁分泌物有關(guān)。Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，予以CFTR基因敲除后的細(xì)胞可明顯減少白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-10和腫瘤壞死因子-α等炎癥介質(zhì)表達(dá)。Wen等[26]研究發(fā)現(xiàn)Hp感染會(huì)損害十二指腸黏膜碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CFTR和SLC26A6的表達(dá)和功能活性。Liu等[27]研究顯示，胃癌患者CFTR和CA199濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)，且組合的CFTR、CA199和CEA作為胃癌診斷標(biāo)志物產(chǎn)ROC曲線下面積0.875，具有較高診斷價(jià)值。綜上所述，CFTR是可能是CAG的關(guān)鍵靶標(biāo)，并具有較高的價(jià)值。

載脂蛋白A1是血漿脂蛋白部分，是高密度脂蛋白的主要蛋白組成，可以有效阻止T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的相互作用，抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而改善炎癥的“瀑布效應(yīng)”[28]。本研究顯示載脂蛋白A1可能是CAG的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要分布在脂肪的消化吸收、PPAR信號(hào)通路上。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胃組織中載脂蛋白A1的表達(dá)上調(diào)，并具有顯著性差異;與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)觀察組（安胃湯干預(yù)組）高、中、低劑量組中胃組織CFTR蛋白表達(dá)下調(diào)，并具有顯著性差異。載脂蛋白A1的表達(dá)對(duì)于CAG的脂肪的消化吸收具有重要作用。載脂蛋白A1的表達(dá)對(duì)于消化系統(tǒng)常見疾病也具有重要的意義。Stoye等[29]發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A1的表達(dá)水平可改變阿爾茨海默病大鼠的胃腸道功能。周揚(yáng)和田亞平[30]研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A1在胃癌和不典型增生的鑒別診斷中有著重要的意義。高艷紅等[31]研究顯示胃癌組和結(jié)直腸癌組血清載脂蛋白A1水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），結(jié)果提示載脂蛋白A1可能在腫瘤發(fā)展過程中有某種重要作用。載脂蛋白A1可能是胃癌新的潛在生物標(biāo)志物，聯(lián)合檢測(cè)其他蛋白可能會(huì)提高胃癌診斷的特異度及靈敏度。綜上所述，載脂蛋白A1可能是CAG疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并與脂肪的消化吸收有重要作用。

綜上所述，本研究將生物芯片大數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，從一個(gè)整體的層面上發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A1、CD36、CFTR是CAG發(fā)病的關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用機(jī)制，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CD36在CAG胃組織中表達(dá)下調(diào)，載脂蛋白A1和CFTR的表達(dá)上調(diào)。并與胃酸分泌、脂肪的消化吸收、PPAR信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路有關(guān)。安胃湯干預(yù)能夠顯著改善CAG大鼠胃組織中CD36、載脂蛋白A1和CFTR的表達(dá)。作為CAG的核心蛋白，是否也作為其他藥物靶點(diǎn)值得進(jìn)一步去研究。

本研究為單中心大鼠的小樣本研究也存在不足。亟待進(jìn)行多中心、大樣本的臨床研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Marques-Silva L，Areia M，Elvas L，et al.Prevalence of gastric precancerous conditions：a systematic review and meta-analysis[J].Eur J Gastroenterol Hepatol，2014，26（4）：378-387.

[2]羅曉明，宋仙平，秦威，等.幽門螺桿菌的感染現(xiàn)狀和診斷治療進(jìn)展[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2019，30（6）：646-649.

[3]Du Y，Bai Y，Xie P，et al.Chronic gastritis in China：a national multi-center survey[J].BMC Gastroenterol，2014，14：21.

[4]留甜甜，宋亞剛，田碩，等.基于中西醫(yī)臨床病癥特點(diǎn)的慢性萎縮性胃炎動(dòng)物模型分析[J].中國中藥雜志，2021，46（4）：777-781.

[5]Sugano K，TackJ，KuipersEJ，et al; Kyoto global consensus report on Helicobacter pylori gastritis[J].Gut，2015，64（9）：1353-1367.

[6]吳承芳.安胃湯聯(lián)合四聯(lián)療法治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎寒熱錯(cuò)雜證的臨床觀察[D].南寧：廣西中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[7]廖冬燕，朱永蘋，張學(xué)寧，等.安胃湯治療慢性萎縮性胃炎療效與安全性觀察[J].廣西中醫(yī)藥，2015，38（1）：12-15.

[8]魏偉，吳希美，李遠(yuǎn)見.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：71.

[9]世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì).網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南[J].世界中醫(yī)藥，2021，16（4）：527-532.

[10]唐旭東，張翠萍，張琪，等.改良式Hp感染萎縮性胃炎大鼠模型的建立[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，48（3）：247-249，252.

[11]劉賡，張聲生.調(diào)肝理脾法治療慢性萎縮性胃炎[J].世界中醫(yī)藥，2015，10（5）：695-698.

[12]仝小林，吳義春，穆蘭澄，等.經(jīng)方大劑量探索[J].上海中醫(yī)藥雜志，2010，44（1）：18-21.

[13]王曉燕.半夏瀉心湯常用劑量與經(jīng)方本源劑量的比較[J].河南中醫(yī)，2011，31（9）：958-961.

[14]紀(jì)萬里，王婷婷，安叡，等.基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探究半夏瀉心湯對(duì)慢性胃炎大鼠影響的作用機(jī)制[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2021，27（9）：1-8.

[15]周慶華，王紅梅.丹參對(duì)胃黏膜損傷的保護(hù)作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（5）：582-585.

[16]劉晨萍，李毅平.安胃湯加味治療脾虛血瘀型慢性萎縮性胃炎的療效及對(duì)患者血液流變學(xué)的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，33（1）：28-31.

[17]朱健敏.安胃湯加味治療慢性萎縮性胃炎胃陰虧虛證的臨床研究[D].南寧：廣西中醫(yī)藥大學(xué)，2018.

[18]Wu W，Wang S，Liu Q，et al.AMPK facilitates intestinal long-chain fatty acid uptake by manipulating CD36 expression and translocation[J].FASEB J，2020，34（4）：4852-4869.

[19]Chen Y，Yang M，Huang W，et al.Mitochondrial Metabolic Reprogramming by CD36 Signaling Drives Macrophage Inflammatory Responses[J].Circ Res，2019，125（12）：1087-1102.

[20]Farokhzadian J，Mangolian Shahrbabaki P，Bagheri V.S100A12-CD36 axis：A novel player in the pathogenesis of atherosclerosis？[J].Cytokine，2019，122：154104.

[21]Febbraio M，Hajjar DP，Silverstein RL.CD36：a class B scavenger receptor involved in angiogenesis，atherrosclerosis.inflammation，and lipid metabolism[J].J Clin Invest，2001，108（6）：785-791.

[22]Febbraio M，Guy E，Coburn C，et al.The impact of overexpression and deficiency of fatty acid translocase（FAT）/CD36[J].Mol Cell Biochem，2002，239（1-2）：193-197.

[23]王毅群，董怡，涂治才，等.吡啶羧酸鉻通過AMPK信號(hào)通路促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36的轉(zhuǎn)位[J].中國臨床藥學(xué)雜志，2011，20（4）：193-197.

[24]Linsdell P.Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（CFTR）：Making an ion channel out of an active transporter structure[J].Channels（Austin），2018，12（1）：284-290.

[25]Zhang S，Shrestha CL，Wisniewski BL，et al.Consequences of CRISPR-Cas9-Mediated CFTR Knockout in Human Macrophages[J].Front Immunol，2020，11：1871.

[26]Wen G，Jin H，Deng S，et al.Effects of Helicobacter pylori Infection on the Expressions and Functional Activities of Human Duodenal Mucosal Bicarbonate Transport Proteins[J].Helicobacter，2016，21（6）：536-547.

[27]Liu H，Wu W，Liu Y，et al.Predictive value of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（CFTR） in the diagnosis of gastric cancer[J].Clin Invest Med，2014，37（4）：E226-232.

[28]Wu J，Wang Y，Li H，et al.Serum apolipoprotein B-to-apolipoprotein A1 ratio is independently associated with disease severity in patients with acute pancreatitis.[J].Sci Rep，2019，9（1）：7764.

[29]Stoye NM，Dos Santos Guilherme M，Endres K.Alzheimer′s disease in the gut-Major changes in the gut of 5xFAD model mice with ApoA1 as potential key player[J].FASEB J，2020，34（9）：11883-11899.

[30]周揚(yáng)，田亞平.血清學(xué)指標(biāo)聯(lián)合篩查對(duì)胃癌診斷的臨床意義[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2014，21（5）：520-524.

[31]高艷紅，張妍，田亞平，等.不同類型腫瘤患者的血脂水平分析[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2010，17（5）：277-280.

（2021-05-19收稿 本文編輯：吳珊，徐穎）