不同濃度 EDTA 對產(chǎn) ESBL多重耐藥大腸埃希菌抗菌藥物敏感性的恢復(fù)作用

溫慶輝， 黎鳳英， 李燕嫦， 黃金印， 王鳳平

（1. 東莞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 東莞 523059；2. 東莞謝崗醫(yī)院檢驗(yàn)科；廣東 東莞 523059）

近年來，由于抗菌藥物的廣泛使用，臨床耐藥菌株的分離率越來越高。大腸埃希菌是臨床醫(yī)院感染分離率較高的菌種，也是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase，ESBL）細(xì)菌的代表菌種。產(chǎn)ESBL的多重耐藥大腸埃希菌對青霉素類、氨基糖苷類、磺胺類及頭孢菌素類抗菌藥物的耐藥率均較高，甚至β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方藥物在其耐藥性方面也沒有明顯優(yōu)勢，對于臨床治療而言，這是一個巨大的挑戰(zhàn)[1]。ESBL易與其他耐藥基因融合，使細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性，因此大腸埃希菌在肺部感染、泌尿系感染、血流感染等患者抗感染治療時，常產(chǎn)生多重耐藥性，可能延誤治療最佳時機(jī)，造成嚴(yán)重的后果[2]。因此，尋找對產(chǎn)ESBL的多重耐藥大腸埃希菌有效的抑菌、殺菌措施，成為臨床上亟待解決的問題之一。乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）可與許多陽離子結(jié)合成復(fù)合物，被廣泛用于穩(wěn)定劑和螯合劑中。除此之處，EDTA還能夠通過限制生長必需的陽離子來破壞細(xì)菌細(xì)胞膜中的二價配合物，起到抑菌作用。目前，大部分關(guān)于EDTA的研究主要集中在其作為抗菌劑防止致病菌污染等方面，且均為高濃度的EDTA，是通過抑制細(xì)菌生長來抑制生物被膜的形成，或通過EDTA螯合特性產(chǎn)生的殺菌效果來清除成熟的生物被膜，關(guān)于EDTA與多重耐藥大腸埃希菌抗菌藥物敏感性恢復(fù)作用的研究較少。本研究擬通過分析不同濃度EDTA聯(lián)合抗產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），探討不同濃度EDTA對產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌抗菌藥物敏感性的恢復(fù)作用，為臨床用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2018年6月—2020年1月東莞市人民醫(yī)院臨床細(xì)菌感染患者送檢的中段尿、血液等各類臨床樣本中分離得到的240株產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）購自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1 EDTA稀釋 用去離子水將EDTA（批號890201D，上海試劑總廠）分別稀釋為低濃度（0.5 mg/mL）、標(biāo)準(zhǔn)濃度（1.0 mg/mL）與高濃度（2.0 mg/mL），37 ℃保存。抗菌藥物頭孢哌酮、左氧氟沙星等均購自英國Oxoid公司。

1.2.2 菌株鑒定 嚴(yán)格按照第4版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》要求分離、培養(yǎng)細(xì)菌，采用法國生物梅里埃公司VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2.3 體外藥物敏感性試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)，嚴(yán)格按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100文件[3]要求判讀結(jié)果。

1.2.4 ESBL檢測 采用雙紙片擴(kuò)散確證法[3]檢測ESBL，藥物敏感性平板和菌液的制備與常規(guī)藥物敏感性試驗(yàn)相同，將菌液涂于M-H瓊脂平板（上海滬宇生物科技有限公司）上，貼上藥敏紙片，1張為三代頭孢菌素，1張為含有β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（克拉維酸10 mL）的紙片，2張紙片中心對中心相距為25～30 mm，35 ℃保存，24 h后觀察結(jié)果，顯示協(xié)同則表示為陽性，相反則為陰性。

1.2.5 MIC測定 在分離出的240株產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌中隨機(jī)選取80株，采用瓊脂平皿二倍稀釋法[4]，分陰性組、藥物組和藥物+EDTA組（平皿中加入2 mmol/L EDTA 1 mL），每組加入106CFU/mL產(chǎn)ESBL大腸埃希菌臨床分離株菌懸液[挑取瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的臨床分離菌株，用無菌0.9%氯化鈉溶液調(diào)制成0.5個麥?zhǔn)蠁挝槐葷岫鹊木鷳乙海s1.5×108CFU/mL），再用無菌0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋]，加入已含有高、中、低3個濃度EDTA和抗菌藥物的MH瓊脂平皿中，37 ℃培養(yǎng)16～24 h后觀察結(jié)果，以沒有細(xì)菌生長的抗菌藥物稀釋最小濃度的平皿為被測抗菌藥物的MIC。比較EDTA低濃度組（0.5 mg/mL）、標(biāo)準(zhǔn)濃度組（1 mg/mL）和高濃度組（2 mg/mL）多種抗菌藥物的MIC。

1.2.6 觀察指標(biāo) 分析檢出產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌樣本類型的分布情況；產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥情況和敏感情況；比較藥物組與藥物+EDTA組MIC的變化；比較不同濃度EDTA對抗菌藥物MIC的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌樣本類型分布

共分離出240株產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌，其中中段尿樣本分離率最高，為47.92%（115株），其次為血液樣本（38株，15.83%）。見表1。

表1 產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌樣本類型分布

2.2 產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌對常用抗菌藥物的耐藥和敏感情況

240株產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌對頭孢哌酮、阿米卡星的敏感性較高（＞90%），對頭孢噻肟的耐藥率為100%，對頭孢吡肟、氨曲南、妥布霉素的耐藥率＞50%，見表2。

表2 產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌對常用抗菌藥物的耐藥性

2.3 藥物組和藥物+EDTA組產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌MIC

藥物組與藥物+EDTA組MIC差異較大，其中頭孢哌酮、左氧氟沙星、頭孢吡肟的MIC差異最明顯，其次是阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素，氨曲南變化較小，頭孢噻肟無變化。見表3。

表3 藥物組和藥物+EDTA組產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的MIC mg/L

2.4 不同濃度EDTA組產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌抗菌藥物MIC測定結(jié)果

抗菌藥物聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)濃度和高濃度EDTA時，MIC變化比聯(lián)合低濃度EDTA時更為顯著，但聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)濃度與高濃度EDTA的MIC無差異。頭孢噻肟MIC在3個濃度EDTA組中均無變化。見表4。

表4 不同濃度EDTA組產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌的MIC mg/L

3 討論

大腸埃希菌作為產(chǎn)ESBL的代表菌種，其多重耐藥與細(xì)菌外排泵功能增強(qiáng)、膜通透性下降有關(guān)。此外，生物被膜的形成使大腸埃希菌對多種抗菌藥物產(chǎn)生抵抗力。細(xì)菌形成生物膜往往會導(dǎo)致抗菌藥物治療失敗。EDTA是一種重要的螯合劑，用途廣泛，不僅可以作為洗滌劑，也是螯合劑的代表性物質(zhì)，能和堿金屬等形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物[5]，更可以作為血液抗凝劑[6]用于臨床。

本研究共分離出240株產(chǎn)ESBL多重耐藥大腸埃希菌，其中尿液樣本分離率最高，其次為血液樣本和呼吸道分泌物，與展冠軍等[7]的研究結(jié)果基本一致。有研究發(fā)現(xiàn)，EDTA對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抑菌活性[8]；HAMOUD等[9]指出抗菌肽與EDTA聯(lián)用可導(dǎo)致銅綠假單胞菌成熟生物膜生成量顯著下降；MAISETTA等[10]證實(shí)了EDTA的協(xié)同抗菌作用，發(fā)現(xiàn)EDTA可顯著降低銅綠假單胞菌對所有抗菌藥物的MIC。本研究中，藥物組和藥物+EDTA組頭孢哌酮、左氧氟沙星、頭孢吡肟的MIC差異最明顯，其次是阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素。氨曲南MIC變化較小，頭孢噻肟無變化，與相關(guān)研究結(jié)果[11]一致。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)抗菌藥聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)濃度及高濃度EDTA時，其抗菌藥物MIC變化比聯(lián)合低濃度EDTA時更為顯著，但聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)濃度與高濃度EDTA的MIC無差異；3個EDTA濃度組中頭孢噻肟的MIC均無變化。有研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用EDTA后，環(huán)丙沙星、慶大霉素、氨芐西林的MIC分別由0.125、0.5、128 μg/mL降至分別由0.004、0.25、4 μg/mL[12-14]。EDTA主要通過破壞生物膜結(jié)構(gòu)，顯著降低生物膜胞外多糖和活菌比例，顯著降低生物膜厚度、平均擴(kuò)散距離和結(jié)構(gòu)熵[15]。郭志華等[16]發(fā)現(xiàn)，低濃度EDTA同樣能影響細(xì)菌生物被膜的形成，但并不是隨著EDTA濃度的增長呈相關(guān)變化，高濃度EDTA與低濃度EDTA相比，并未增加細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，與本研究結(jié)論一致。

綜上所述，不同濃度的EDTA對多數(shù)被測菌株均有顯著的協(xié)同抗菌作用，能明顯降低細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，具有重要的臨床意義。其優(yōu)點(diǎn)在于，一方面可以減少藥物過量導(dǎo)致的耐藥性增高的現(xiàn)象，另一方面可以通過MIC來確定最佳藥物劑量，縮短用藥時間，從而減輕多重耐藥菌感染患者的負(fù)擔(dān)。