宏基因組二代測序技術(shù)診斷快速進(jìn)展肺奴卡菌病1例*

劉美紅，賀環(huán)宇，李艷霞，董 暢

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116001)

奴卡菌是一種革蘭染色陽性、弱抗酸染色陽性的絲狀細(xì)菌，廣泛存在于土壤中，目前，已發(fā)現(xiàn)100多個亞種，其中50多個亞種可對人類致病，以星形奴卡菌最為多見。在免疫缺陷人群及慢性氣道病患者中易發(fā)生機(jī)會性感染[1]，可累及肺部、皮膚、關(guān)節(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多個器官系統(tǒng)，以肺部感染最為多見，常引起致死性病變，病死率極高。日本學(xué)者進(jìn)行的一項(xiàng)研究觀察了30例肺奴卡菌病患者的臨床結(jié)局，結(jié)果顯示，病死率達(dá)56.7%[2]。因此，快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷和合理的抗生素方案對肺奴卡菌病患者的治療至關(guān)重要。然而，奴卡菌生長速度緩慢，傳統(tǒng)病原學(xué)培養(yǎng)耗時較長，且常出現(xiàn)假陰性，給臨床診治帶來很大困難。近年來，宏基因組二代測序技術(shù)(mNGS)在感染性疾病診斷中的臨床應(yīng)用價值已得到公認(rèn)，本院收治快速進(jìn)展肺奴卡菌病患者1例，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

患者，男，63歲，農(nóng)民。以間斷發(fā)熱、大量膿痰半年，加重伴呼吸困難1周于2019年9月4日收入院。患者入院前近半年反復(fù)發(fā)熱，以低熱為主，咳嗽，咳大量膿痰，最多可達(dá)200～300 mL/d，期間間斷應(yīng)用抗生素(具體不詳)及地塞米松治療，上述癥狀可緩解。1周前患者體溫突然升至38 ℃，并出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸窘迫，床上活動、翻身等難以耐受，故來本院就診。近半年患者體重下降約10 kg，既往左肺下葉支氣管擴(kuò)張病史30余年。入院查體：體溫37.3 ℃，脈搏130次/分，呼吸頻率34次/分，血壓90/55 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，血氧飽和度85%(未吸氧)。呼吸急促，口唇發(fā)紺，雙肺可聞及濕啰音。5 L/min吸氧時動脈血?dú)夥治鎏崾竞粑ソ?pH 7.445，動脈血氧分壓79 mm Hg，動脈血二氧化碳分壓34.4 mm Hg)。外周血白細(xì)胞增多(白細(xì)胞35.3×109L-1，中性粒細(xì)胞95.7%，不成熟粒細(xì)胞2%)。C反應(yīng)蛋白381 mg/L，降鈣素原7.05 ng/mL，炎癥標(biāo)志物檢測均明顯升高。生化檢測：清蛋白26.2 g/L，提示低蛋白血癥。淋巴細(xì)胞亞群檢測：CD4+淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)161 μL-1，CD8+淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)38 μL-1，提示患者免疫功能低下。入院時胸部CT檢查顯示雙肺散在結(jié)節(jié)、浸潤影，伴左下葉支氣管擴(kuò)張。見圖1A～C。

留取血、痰標(biāo)本培養(yǎng)后初始治療給予美洛西林鈉舒巴坦鈉、莫西沙星聯(lián)合伏立康唑經(jīng)驗(yàn)性抗感染。然而觀察72 h后，患者病情未見明顯改善，體溫升至38.8 ℃，仍有大量膿痰，呼吸困難進(jìn)一步加重，血氧飽和度降至77%。痰培養(yǎng)結(jié)果為白色念珠菌，考慮為口腔污染菌，多次進(jìn)行血培養(yǎng)、痰結(jié)核菌、聚合酶鏈反應(yīng)檢查均為陰性。入院第5天復(fù)查胸部CT顯示雙肺病灶迅速滲出和實(shí)變，較前明顯進(jìn)展。見圖1D～F。故升級抗生素方案為美羅培南、利奈唑胺聯(lián)合伏立康唑抗感染治療。同時，為進(jìn)一步查找病原體完善纖維支氣管鏡檢查，鏡下見大量膿性痰液，保護(hù)性毛刷刷取痰液進(jìn)行培養(yǎng)，留取支氣管肺泡灌洗液行mNGS檢測。收集5 mL肺泡灌洗液至無菌離心管中，并放置-20 ℃冰箱保存。干冰快遞至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行宏基因組檢測。主要過程包括核苷酸提取、文庫構(gòu)建、測序和生物信息學(xué)分析[3]。取600 μL肺泡灌洗液加入玻璃珠和酶混合震蕩后按TIANamp Micro DNA Kit (DP316)試劑盒步驟提取DNA。提取后的DNA超聲破碎成小片段。使用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)控文庫插入片段的大小為200～300 bp，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit質(zhì)控DNA文庫濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫通過滾環(huán)復(fù)制生成DNB納米球。將制備好的DNB納米球加載到測序芯片，通過BGISEQ-50測序儀進(jìn)行測序[4]。測序數(shù)據(jù)下機(jī)后去除低質(zhì)量序列(長度小于35 bp)以獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)。通過BWA比對將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對上人參考基因組(hg19)序列的數(shù)據(jù)去除[5]。剩下的數(shù)據(jù)在去除低復(fù)雜度序列后與華大病原體宏基因組數(shù)據(jù)庫(包括6 350種細(xì)菌、1 064種真菌、4 945種病毒、234種寄生蟲)進(jìn)行比對。最后從完整的微生物列表中刪除可疑的背景微生物，再根據(jù)LANGELIER等[6]研究確定病原學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算微生物相對豐度并依次排序。4 d后mNGS結(jié)果回報，測序下機(jī)數(shù)據(jù)一共得到25 849 540條序列，在去除人源序列之后獲得575 370條(2.23%)微生物序列，比對到細(xì)菌的序列數(shù)最多(28 969條)，細(xì)菌中比對到奴卡氏菌屬的序列比例(屬水平上奴卡氏菌的相對豐度)最高[66.03%(19 129/28 969)]。嚴(yán)格比對到膿腫奴卡氏菌屬的序列為7 284條，其基因組覆蓋率為8.75%。見圖2。未檢測到其他細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲。故診斷為肺奴卡菌病，立即調(diào)整治療方案為復(fù)方新諾明、亞胺培南聯(lián)合利奈唑胺。同時，提醒實(shí)驗(yàn)室延長培養(yǎng)時間，13 d后痰培養(yǎng)奴卡菌陽性，證實(shí)了mNGS檢測的結(jié)果。見圖3。然而，針對性調(diào)整抗生素方案后患者臨床癥狀并未出現(xiàn)明顯緩解，第22天復(fù)查胸部CT顯示左上葉結(jié)節(jié)進(jìn)展為厚壁空洞，直徑約為23 mm，與之前的胸部CT比較，雙肺多發(fā)實(shí)變影沒有明顯吸收。見圖1G～I(xiàn)。在查閱了膿腫奴卡菌抗生素耐藥性的相關(guān)文獻(xiàn)后[7-8]，決定加用阿米卡星以覆蓋亞胺培南耐藥菌種。治療3周后患者好轉(zhuǎn)，出院繼續(xù)口服復(fù)方新諾明。出院2個月后復(fù)查胸部CT顯示空洞病灶已閉合，雙肺野浸潤影明顯吸收。見圖4。

2 討 論

奴卡菌在1888年首先由Edmund Nocad在被感染牛的肉芽腫病變中發(fā)現(xiàn)，1891年Epinger發(fā)現(xiàn)了首例人類奴卡菌病，累及肺、腦而致死[9]。肺奴卡菌病是一種罕見的肺部感染性疾病，好發(fā)于免疫缺陷宿主和慢性氣道病患者，發(fā)病率為0.39/10萬～0.55/10萬[10]；但隨著近年來器官移植技術(shù)的發(fā)展和免疫抑制劑應(yīng)用的增加，發(fā)病率呈上升趨勢，從1997-1998年的0.33/10萬增至2007-2008年的0.87/10萬[11]。肺奴卡菌病起病隱匿，呈慢性病程，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，最初常表現(xiàn)為發(fā)熱、咳大量膿痰；咳嗽、胸痛和厭食也經(jīng)常出現(xiàn)，有些患者甚至沒有癥狀，僅在胸部X線檢查時發(fā)現(xiàn)異常陰影，從而確診[2]。實(shí)驗(yàn)室檢查常發(fā)現(xiàn)低蛋白血癥。影像學(xué)檢查常表現(xiàn)為孤立、散在的結(jié)節(jié)或腫塊，主要在胸膜下或肺門附近[12]。病原學(xué)診斷是確診肺奴卡菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于奴卡菌生長速度緩慢，傳統(tǒng)的病原學(xué)培養(yǎng)耗時較長，從診斷取樣開始到最終確診需3～35 d，中位13.6 d[13]，所以，經(jīng)常會延遲診治，甚至出現(xiàn)漏診?；谏鲜鲈?，肺奴卡菌病患者預(yù)后極差，約30%的患者需進(jìn)入重癥監(jiān)護(hù)病房治療，1年病死率為31%[14]。還有研究將器官移植后奴卡菌感染與非奴卡菌感染患者的1年后病死率進(jìn)行比較分析，奴卡菌感染的器官移植患者1年后病死率較未感染者高10倍[15]。因此，早期快速診斷對肺奴卡菌病患者至關(guān)重要。在肺奴卡菌病的治療方面，中國指南推薦首選復(fù)方新諾明[16]；但近年來磺胺類藥物的耐藥率有增加趨勢，單獨(dú)使用復(fù)方新諾明療效欠佳，可聯(lián)用利奈唑胺、阿米卡星等同樣高敏感性藥物[17]，療程一般為4～5個月。

mNGS是一種新興的分子生物學(xué)技術(shù)，采用非靶向測序方法直接從患者臨床樣本中檢測所有潛在病原體，在不明原因感染和免疫功能低下合并感染患者中的臨床應(yīng)用價值已得到證實(shí)[18-20]。與傳統(tǒng)的檢測方法比較，mNGS具有很大的優(yōu)勢，特別是在檢測罕見、生長緩慢或不易培養(yǎng)的病原體方面。有研究表明，mNGS有助于重癥肺炎的診斷，并可能降低重癥監(jiān)護(hù)病房患者的病死率[21]。本例患者mNGS檢測結(jié)果在4 d內(nèi)回報，而痰液培養(yǎng)分離出奴卡菌耗時13 d。對早期抗感染治療失敗、進(jìn)展迅速的肺奴卡菌病重癥患者來說，在mNGS的幫助下進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷，從而轉(zhuǎn)向靶向抗生素治療是挽救生命的關(guān)鍵。此外，mNGS對致病微生物的精準(zhǔn)分類為評估抗生素耐藥性提供了重要信息。然而，mNGS的臨床應(yīng)用并非沒有挑戰(zhàn)，除高人源序列干擾導(dǎo)致靈敏度不足外，在mNGS檢測結(jié)果的判讀方面，如區(qū)分病原體定植和污染也存在爭議，目前為止還沒有統(tǒng)一權(quán)威的判讀標(biāo)準(zhǔn)。在實(shí)驗(yàn)室檢測方面，多個參數(shù)需要考慮，如比對序列數(shù)、相對豐度、基因組覆蓋率、測序深度等。在臨床實(shí)踐中，臨床醫(yī)師需根據(jù)某些微生物的致病性、患者臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特點(diǎn)確定mNGS檢測到的微生物的意義。因此，mNGS提供的可操作信息復(fù)雜，限制了其臨床應(yīng)用。但mNGS在疑難雜癥、危重癥、免疫缺陷等特殊人群中仍具有成為病原體診斷準(zhǔn)一線檢測手段的潛力，是一種非常有效的廣譜病原體篩查方法[22]。

總之，本院收治的1例快速進(jìn)展肺奴卡菌病患者應(yīng)用mNGS在早期得到快速診斷，最終治愈出院。與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法比較，mNGS在發(fā)現(xiàn)罕見病原體、縮短診斷時間、改進(jìn)抗生素方案和改善患者預(yù)后等方面均展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。