Fscn2基因過表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)的耳蝸細(xì)胞凋亡的抑制作用

王 巖 商文靜 韓鋒產(chǎn)

濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山東省醫(yī)藥衛(wèi)生耳科遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 煙臺(tái) 264003

Fscn2是Fascin家族的一員，F(xiàn)scn2可與F-actin交聯(lián)成剛性平行的纖毛束[1]。Perrin等[2]研究DBA/2J增齡性聾小鼠發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)scn2與β-actin相互作用維持了小鼠的靜纖毛長度和聽覺功能。Yang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，DBA/2J小鼠耳蝸細(xì)胞凋亡導(dǎo)致其早期聽力減退，通過抗凋亡治療可減輕耳蝸細(xì)胞的凋亡。敲低Fscn2基因增加了腎小管上皮細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的易感性。Fscn2在C2細(xì)胞【敲低α(E-Catenin的NRK-52E細(xì)胞)】中的過表達(dá)降低C2細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性[4]。這些研究表明，F(xiàn)scn2不僅是一種結(jié)構(gòu)蛋白，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)的功能。

順鉑是一種高效的抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于各種癌癥的治療，包括頭頸部癌、胃癌等[5]。但在接受順鉑化療后，約40%～80%的成人和至少50%的兒童出現(xiàn)永久性的聽力損失[6]。順鉑的耳毒性在臨床上主要表現(xiàn)為雙側(cè)、漸近性和不可逆的感音性神經(jīng)聽力損失[7]。本研究旨在探討Fscn2基因的過表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)耳蝸細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HEI-OC1(house ear institute-organ of corti 1)耳蝸細(xì)胞來自豪斯耳科學(xué)研究所(House Ear Institute)。血清購自Gibco公司(貨號為16140-071)；高糖購自Hyclone公司(貨號為SH30023.01)；嘌呤霉素購自Meilunbio公司(貨號為MA0318)；Rabbit Anti Bcl-2 antibody購自Proteintech公司(貨號為26593-1-AP)；FITC-Annexin V試劑盒購自BD公司(貨號為556547)；Anti C-caspase3 antibody購自CST公司(貨號為9505)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 慢病毒感染耳蝸細(xì)胞 構(gòu)建表達(dá)Fscn2病毒載體(主要原件見表1)包裝慢病毒顆粒。培養(yǎng)HEI-OC1細(xì)胞(33℃，10% CO2)，當(dāng)貼壁率達(dá)到30%～40%時(shí)可進(jìn)行慢病毒感染。將細(xì)胞培養(yǎng)液、慢病毒、慢病毒感染增強(qiáng)液按照989∶10∶1的比例混勻，配制成慢病毒感染培養(yǎng)液。以換液形式加入六孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出，棄除慢病毒感染培養(yǎng)液，1×PBS清洗2次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液(2 mL/孔)。培養(yǎng)48 h后，加入含6 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)液篩選得到Fscn2穩(wěn)定表達(dá)株。

表1 Fscn2病毒載體結(jié)構(gòu)

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率 構(gòu)建外源性Fscn2過表達(dá)載體，包裝病毒顆粒，感染耳蝸細(xì)胞，獲得Fscn2過表達(dá)的耳蝸細(xì)胞模型(以下簡稱為Fscn2-o/e細(xì)胞)。同樣方法獲得對照組細(xì)胞，即E.V.細(xì)胞。收集E.V.細(xì)胞和Fscn2-o/e細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按5 000細(xì)胞/孔加入96孔板中，補(bǔ)培養(yǎng)液至100 μL，混勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸掉96孔板中的培養(yǎng)液并用PBS洗2次。以換液的方式加入含有順鉑的培養(yǎng)液，順鉑濃度為30 μM。培養(yǎng)24 h后，配置含10%WST-8【化學(xué)名為2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽】的培養(yǎng)液，以換液的形式加入96孔板(100 μL/孔)。設(shè)置空白孔，只含10% WST-8的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱2 h后，96孔板放入酶標(biāo)儀中，測定順鉑干預(yù)的E.V.細(xì)胞和Fscn2-o/e細(xì)胞在450 nm處吸光度并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=順鉑干預(yù)細(xì)胞的OD值/順鉑未干預(yù)的細(xì)胞的OD值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 進(jìn)行E.V.細(xì)胞和Fscn2-o/e細(xì)胞培養(yǎng)，收集細(xì)胞，離心去上清，加入1 mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。六孔板每孔加300 μL細(xì)胞懸液，再加700 μL培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱。待E.V.細(xì)胞和Fscn2-o/e細(xì)胞長滿，以換液的方式加入含有順鉑的培養(yǎng)液，順鉑濃度為30 μM。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞(包括懸液中的細(xì)胞)，按 1∶9 稀釋結(jié)合緩沖液得到1×結(jié)合緩沖液。用1×結(jié)合緩沖液懸浮E.V.細(xì)胞和Fscn2-o/e細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度約為1×106/mL。分別取100 μL的E.V.細(xì)胞和Fscn2-o/e細(xì)胞懸液于2 mL EP管中，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI混勻，室溫避光孵育15 min。加入400 μL PBS，轉(zhuǎn)移至5 μL 流式管中立刻放入流式細(xì)胞儀(Bekmancoulter EPICS-XL,美國)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

1.2.4 Western Blot 將E.V.細(xì)胞和Fscn2-o/e細(xì)胞接種到6孔板。待E.V.細(xì)胞和Fscn2-o/e細(xì)胞長滿后(約24 h)，以換液的方式加入含有30 μM順鉑的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，收集E.V.細(xì)胞和Fscn2-o/e細(xì)胞加入裂解液(PMSF∶RIPA=1∶100)80 μL，靜置10 min，震蕩15 s。在4 ℃下，12 000 r/min離心15 min，收集上清。BCA法測定蛋白濃度，計(jì)算上樣量。配制10%的SDS-PAGE凝膠，分別將順鉑干預(yù)的E.V.細(xì)胞蛋白樣品和Fscn2-o/e細(xì)胞蛋白樣品加入梳孔中，電壓設(shè)置為110 V進(jìn)行電泳120 min。將蛋白樣品轉(zhuǎn)到PVDF膜上，電流為200 mA，時(shí)間為110 min。將PVDF膜放入封閉液中，封閉2 h。一抗(抗Fscn2、Bcl-2、Cleaved caspase-3的抗體)用TBST稀釋。將一抗稀釋液加入密封袋中，放入PVDF膜，封口，4℃搖床上孵育過夜。第二天將膜取出，用TBST快速洗10 min，重復(fù)3次，用TBST將按照1∶5 000的比例稀釋二抗，室溫?fù)u床慢速孵育2 h，用ECL化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1Fscn2過表達(dá)耳蝸細(xì)胞模型的鑒定 Western blot對構(gòu)建的Fscn2過表達(dá)耳蝸細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，F(xiàn)scn2-o/e細(xì)胞的Fscn2蛋白的表達(dá)量高于E.V.細(xì)胞(圖1)。

兩組比較，**P<0.01。

2.2Fscn2過表達(dá)耳蝸細(xì)胞增殖能力的檢測 構(gòu)建細(xì)胞模型后，用順鉑進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，在30 μM的順鉑干預(yù)24 h之后，與E.V.細(xì)胞比較，F(xiàn)scn2-o/e細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，P<0.01(圖2)。

兩組比較，**P<0.01。

2.3Fscn2過表達(dá)耳蝸細(xì)胞凋亡率的檢測 用30 μM順鉑處理Fscn2-o/e細(xì)胞與E.V.細(xì)胞24 h，再用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，在順鉑干預(yù)下，E.V.細(xì)胞的Q2(早中期凋亡細(xì)胞)區(qū)域細(xì)胞占比為12.8 %，Q4(晚期凋亡細(xì)胞)區(qū)域細(xì)胞占比為12 %，而Fscn2-o/e細(xì)胞Q2區(qū)域細(xì)胞占比為7.4%，Q4區(qū)域細(xì)胞占比為9.3 %(圖3A)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，在順鉑干預(yù)后，E.V.細(xì)胞與Fscn2-o/e細(xì)胞的凋亡率比較，P<0.01(圖3B)。本研究提示，F(xiàn)scn2的過表達(dá)能顯著抑制順鉑所致的耳蝸細(xì)胞凋亡。

A為流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；

2.4 Western blot檢測Fscn2過表達(dá)耳蝸細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 為進(jìn)一步研究在順鉑干預(yù)下Fscn2過表達(dá)耳蝸細(xì)胞凋亡率降低的機(jī)制，本研究通過Western blot對凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，30 μM順鉑干預(yù)24 h后，與E.V.細(xì)胞相比，F(xiàn)scn2-o/e細(xì)胞抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)較高，而凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3水平較低(圖4)。本研究提示，F(xiàn)scn2-o/e細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Cleaved-caspase3的水平以對抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

兩組比較，*P<0.05。

3 討論

順鉑誘導(dǎo)耳毒性的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，目前認(rèn)為包括DNA損傷、活性氧(reactive oxygen species，ROS)過量生成和細(xì)胞凋亡在內(nèi)的多種機(jī)制與此有關(guān)[8-9]。順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，造成DNA損傷[10]，引起毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變(ataxia-telangiectasia mutated，ATM)。ATM可以激活腫瘤抑制基因p53，增加促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，后者增加線粒體膜的通透性，使細(xì)胞色素C從線粒體釋放，導(dǎo)致caspase 3的活化[11]。用30 μM的順鉑干預(yù)24 h后，HEI-OC1細(xì)胞的存活率下降約50%，Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)的表達(dá)降低。用Nrf2激活劑—叔丁基氫醌(tertiary butylhydroquinone，TBHQ)對細(xì)胞進(jìn)行處理，細(xì)胞中非線粒體ROS的積累減少，抑制了細(xì)胞的凋亡[12]。此外，α-硫辛酸(alpha lipoic acid，ALA)、海藻糖、小檗堿或黃連素等小分子藥物可抑制順鉑誘導(dǎo)的耳蝸細(xì)胞凋亡[13-15]。

順鉑可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路發(fā)揮其耳毒性[16]。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferase，PRMT3)和大麻素系統(tǒng)的相互作用與順鉑誘導(dǎo)的耳毒性有關(guān)，PRMT3和大麻素系統(tǒng)的相關(guān)蛋白脂肪酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH1)的過表達(dá)調(diào)控順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的水平(如Cleaved-caspase3的表達(dá)升高)[17]。順鉑還可通過使脂質(zhì)過氧化物、鐵元素的堆積以及線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的下降以誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞的鐵死亡，最后引起細(xì)胞凋亡[18]。鐵死亡的抑制劑ferrostatin-1能夠改善順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞凋亡以及耳蝸外植體中線粒體的功能[19]。在順鉑干預(yù)下，注射了AAV2-Pou4f3 shRNA的小鼠耳蝸中凋亡相關(guān)蛋白Bax水平升高，而抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2水平降低。這提示，在順鉑處理后，Pou4f3的低表達(dá)可能增加耳蝸細(xì)胞的凋亡[20]。使用氯喹阻斷自噬可以改善順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞的鐵死亡，這表明，通過鐵死亡誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與細(xì)胞的過度自噬有關(guān)[21]。Fscn2還能改善順鉑所致的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡[22]。

綜上所述，為進(jìn)一步研究Fscn2的過表達(dá)是否抑制順鉑誘導(dǎo)的耳蝸細(xì)胞凋亡，本研究構(gòu)建了Fscn2過表達(dá)的耳蝸細(xì)胞模型。本研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑的干預(yù)下，F(xiàn)scn2-o/e細(xì)胞的增殖能力較高，而細(xì)胞凋亡的水平較低，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平較低。這表明，F(xiàn)scn2基因的過表達(dá)抑制了順鉑誘導(dǎo)的耳蝸細(xì)胞凋亡，F(xiàn)scn2可能是對抗順鉑誘導(dǎo)耳蝸細(xì)胞凋亡的重要因素之一，但詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究利用Fscn2基因過表達(dá)的細(xì)胞模型探討Fscn2對順鉑誘導(dǎo)耳蝸細(xì)胞凋亡的影響，為揭示Fscn2基因的功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。