HBV 相關(guān)DLBCL 患者的病理學(xué)特點及AID 表達差異及與預(yù)后關(guān)系的多因素分析

楊青華，耿東方，李小亞，李印平

（濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院1.醫(yī)學(xué)檢驗科；2.感染性疾病科；3.病理科，河南 安陽 455000）

病毒感染可使惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險明顯增加， 其中惡性腫瘤中增長最快的腫瘤之一是非霍奇金淋巴瘤， 以彌漫性大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma ，DLBCL）最為常見，其在組織形態(tài)、遺傳特征、免疫表型、臨床表現(xiàn)對化療的反應(yīng)和預(yù)后方面高度異質(zhì)[1]。乙肝病毒（Hepatitis B virus ，HBV）感染是全球性的公共衛(wèi)生問題，DLBCL 中的HBV 感染率高于普通人群，并且患者預(yù)后較差[2]。 然而，在DLBCL 發(fā)生和發(fā)展過程中HBV的病因機制仍不清楚。 活化誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶（activation induced cytosine deaminase ，AID） 是一種DNA / RNA 編輯酶， 主要誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶變成尿嘧啶以參與體細胞生發(fā)中心B 細胞免疫球蛋白基因的超突變 （somatic hypermutation ，SHM）和抗體的類別轉(zhuǎn)換重組 （class．switch recombination CSR）過程[3-4]。SHM 和CSR 的異常出現(xiàn)導(dǎo)致目標(biāo)基因突變和染色體易位， 這在大多數(shù)B 細胞淋巴瘤的發(fā)生中起重要作用[5]，因此，AID 在DLBCL 的發(fā)病機理中起重要作用。為了探討HBV 相關(guān)DLBCL患者病理學(xué)特點及AID 表達差異及與預(yù)后關(guān)系的多因素分析，本研究選取2018年1月至2020年3月在我院治療的DLBCL 患者110 例進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年3月在我院治療的DLBCL 患者110 例， 其中男性60例，女性50 例；年齡18～71 歲，＜50 歲62 例，≥50歲48 例。 入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷符合WHO 制定的淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)；（2） 有乙肝五項檢查；（3）接受CHOP 方案或RCHOP 化療方案；（4）臨床隨訪資料保存完整。 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他病毒性肝炎、HIV 感染；（2） 合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；（3）有心、肝、腎等重要臟器疾病。

1.2 實驗室檢查 免疫組化法檢測AID 表達:手術(shù)切除的標(biāo)本組織經(jīng)10%甲醛固定24～48 h， 之后行石蠟包埋。將石蠟標(biāo)本切成厚度約為4 mm 的連續(xù)組織切片4 張， 60℃烘烤3 h，常規(guī)脫蠟，加3%H2O2在室溫下孵育10 min，PBS 洗滌3 次， 每次3 min，檸檬酸溶液修復(fù)，PBS 洗滌3 次，每次3 min，加上一抗(抗AID)孵育過夜，PBS 洗滌，添加聚合物增強劑，在室溫下孵育20 min，PBS 洗滌，添加酶標(biāo)記的抗小鼠聚合物 （二抗）， 在室溫下孵育30 min 用PBS 洗滌3 次，每次3 min，DAB 顯色，用水沖洗，用蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水封片。

AID 抗體購自美國Abcam 公司(ab59361)；DAB 顯色試劑盒、EDTA 修復(fù)液、檸檬酸鹽修復(fù)液、PBS 緩沖液均購自北京中杉金橋公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 22.0 軟件，AID 表達、 性別等資料采用頻數(shù)或百分比表示，組間比較使用χ2檢驗； 生存分析采用Kaplan-Meier法； 采用Cox 回歸分析預(yù)后因素。 檢驗水準(zhǔn)α 為0.05。

2 結(jié)果

2.1 伴和不伴HBsAg 感染患者臨床病理特征比較伴HBsAg 感染患者年齡＜50 歲、 臨床分期Ⅲ～Ⅳ、ALT＞40 U/L、AST＞40 U/L、脾臟受累的比例明顯高于不伴HbsAg 感染患者（P＜0.05）；伴和不伴HBsAg 感染患者性別、結(jié)節(jié)外受累區(qū)域、肝臟受累、IPI評分、ECOG 評分和治療方案比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 伴和不伴HBsAg 感染患者臨床病理特征比較

2.2 伴和不伴HBsAg 感染患者AID 表達情況 伴HBsAg 感染患者AID 陽性表達率明顯高于不伴HBsAg 感染患者（P＜0.05），見表2；AID 蛋白主要表達于細胞質(zhì)，呈棕褐色，見圖1。

表2 伴和不伴HBsAg 感染患者AID 表達情況

圖1 免疫組化染色圖

2.3 HBsAg、AID 表達與患者預(yù)后關(guān)系 HBsAg（+）和AID（+）患者中位生存時間為23 個月（95%CI：21.68～24.32），明顯少于HBsAg（+）和AID（-）、HBsAg（-）和AID（+）、HBsAg（-）和AID（-）患者的35個月 （95%CI：32.95 ～37.05）、36 個月 （95%CI：33.10～37.75）和35 個月（95%CI：32.35～37.65）（ χ2=8.294、41.769 和14.626，P＜0.05）。

HBsAg（+）和AID（-）、HBsAg（-）和AID（+）、HBsAg（-）和AID（-）患者中位生存時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ χ2=1.921、0.822 和1.022，P＞0.05），見圖2。

圖2 生存曲線圖

2.4 多因素分析 Cox 比例風(fēng)險回歸分析結(jié)果顯示：HbsAg 和AID 雙陽性、 臨床分期和IPI 評分是DLBCL 患者預(yù)后的影響因素（HR=2.101、1.882 和2.011，P＜0.05），見表3。

表3 Cox 比例風(fēng)險回歸分析結(jié)果

3 討論

淋巴瘤是淋巴造血系統(tǒng)腫瘤， 目前認為其發(fā)生與病毒感染、自身免疫狀態(tài)和環(huán)境因素有關(guān)[6-7]。近年來，DLBCL 發(fā)生與病毒感染之間的關(guān)系越來越受到關(guān)注， 特別是合并有HBV 感染的DLBCL患者的臨床預(yù)后比單純DLBCL 患者差[8-10]。淋巴瘤患者的免疫功能異常，導(dǎo)致HBV 感染的概率明顯高于健康人[11]。 HBV 分布較廣，研究HBV 感染與DLBCL 之間的關(guān)系具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，伴HBsAg 感染患者年齡＜50歲、 臨床分期Ⅲ～Ⅳ、ALT＞40 U/L、AST＞40 U/L、脾臟受累的比例明顯高于不伴HbsAg 感染患者。結(jié)果表明與陰性組相比，HBsAg 陽性組發(fā)病年齡小、臨床分期晚、脾臟侵襲頻率高，其他研究[12-14]也有類似的結(jié)果。HBV 具有肝細胞吞噬作用，是肝癌最重要的危險因素， 同時也具有淋巴細胞吞噬作用并引起淋巴系統(tǒng)感染， 一旦發(fā)生慢性HBV 感染，長期的抗原刺激而導(dǎo)致DLBCL 的發(fā)生有其生物學(xué)合理性。 因此，HBV 感染可能是DLBCL 發(fā)病機理中的重要危險因素之一[15]。

AID 在生發(fā)中心表達。 在正常情況下，免疫球蛋白基因的體細胞SHM 和CSR 促進抗體親和力成熟和B 細胞表面受體亞型的改變， 導(dǎo)致體細胞異常突變或基因結(jié)構(gòu)改變，最終發(fā)展為腫瘤[16-17]。AID 在濾泡性淋巴瘤、黏膜相關(guān)性淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、 彌漫性大B 細胞淋巴瘤等多種B 細胞腫瘤中表達[18]。AID 導(dǎo)致B 細胞淋巴瘤的機制可能與病原體或發(fā)炎性因子通過核轉(zhuǎn)錄因子KB 信號通路的活化而導(dǎo)致AID 的上調(diào)有關(guān)[19]。 本研究結(jié)果顯示，伴HBsAg 感染患者AID 陽性表達率明顯高于不伴HBsAg 感染患者。 盡管不同文獻報道的DLBCL 患者的HBV 陽性率略有不同，但這些研究都結(jié)果表明DLBCL 患者的HBV 陽性率高于健康對照者。結(jié)果表明DLBCL 中的AID 與HBV感染具有相關(guān)性，AID 可能與DLBCL 中HBV 感染的致病過程有關(guān)。 據(jù)推測，在HBV 相關(guān)的DLBCL中，HBV 感染可以通過慢性刺激連續(xù)刺激AID 的表達，從而促進腫瘤的形成，而HBV 感染是否通過某種機制上調(diào)AID 的表達， 進一步改變下游靶基因，促進DLBCL 的發(fā)生和發(fā)展，仍有待進一步研究。

本研究HBsAg（+）和AID（+）患者中位生存時間明顯少于HBsAg（+）和AID（-）、HBsAg（-）和AID（+）、HBsAg（-）和AID（-）患者。 這說明AID 可能會加速腫瘤的進展并縮短患者的生存時間，進一步表明AID 對于DLBCL 感染HBV 的預(yù)后不良。 多因素分析結(jié)果顯示，HbsAg 和AID 雙陽性、臨床分期和IPI 評分是DLBCL 患者預(yù)后的影響因素。DLBCL 患者需要在治療期間密切監(jiān)測HBV 血清標(biāo)志物和AID 指標(biāo)的動態(tài)變化，并警惕HBV 再次激活引起的嚴重肝損害。

DLBCL 發(fā)病機制復(fù)雜， 且存在多種多樣的分子異常，不同的分子異常表達構(gòu)成了DLBCL 的高度異質(zhì)性[20]。本研究通過對患者AID 蛋白水平進行檢測，表明HBV 也可能通過與AID 相互作用影響DLBCL 發(fā)生發(fā)展及預(yù)后， 支持HBV 可能是DLBCL 發(fā)病的重要危險因素之一的假說， 這為HBV相關(guān)DLBCL 提供一個可能的研究方向。 由于樣本量較少，治療隨訪的不一致性、數(shù)據(jù)的選擇偏移等回顧性研究的缺陷， 目前仍然需要一些前瞻性的研究對本結(jié)論的進一步證實。

綜上所述，伴HBV 感染和不伴HBV 感染DLBCL 患者臨床病理學(xué)特征有所差異，AID 表達與HBV 感染相關(guān)，同時HBV 感染影響患者預(yù)后。