重癥肺炎患者血清circ_0009128 表達(dá)及其與TLR4、免疫功能的相關(guān)性研究

鄭國(guó)平，田孝瑞，苗士領(lǐng)

（河南省第二人民醫(yī)院ICU，河南 鄭州 451191）

肺炎是臨床常見(jiàn)的一種炎癥性疾病， 其主要是相關(guān)因素?fù)p傷機(jī)體后氣道、肺泡等出現(xiàn)炎癥，其中重癥肺炎是指肺炎患者出現(xiàn)急性呼吸衰竭及終末器官功能障礙等情況， 由于重癥肺炎起病迅速及進(jìn)展快導(dǎo)致患者死亡率逐年上升[1-2]。 因而探究重癥肺炎發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制對(duì)臨床治療具有重要意義。 研究表明炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激在肺炎發(fā)生及發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[3]。 重癥肺炎發(fā)生過(guò)程還與機(jī)體免疫功能降低有關(guān)，其中Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）屬于跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體并可參與免疫反應(yīng)[4]。相關(guān)報(bào)道指出環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）屬于一類非編碼RNA 且具有穩(wěn)定性、組織特異性等特點(diǎn)， 還可能參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等多種疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[5]。 研究表明 環(huán) 狀RNA_0009128 （circular RNA_0009128，circ_0009128）在活動(dòng)性肺結(jié)核中呈低表達(dá)，并可能作為活動(dòng)性肺結(jié)核診斷及治療的潛在靶標(biāo)[6]。 但circ_0009128 在重癥肺炎患者中的表達(dá)及其臨床意義尚未完全闡明。 因此，本研究主要探討重癥肺炎患者血清circ_0009128 的表達(dá)水平， 并分析其與炎癥因子、氧化指標(biāo)及免疫功能的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年2月至2018年10月本院收治的重癥肺炎患者90 例為重癥肺炎組，其中男60 例， 女30 例，年齡45～70 歲， 平均年齡（55.36±8.59）歲，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。 排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤患者；免疫功能障礙患者；凝血功能障礙患者；呼吸衰竭患者。 選取同期普通肺炎患者80 例為普通肺炎組， 所有患者均符合普通肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，其中男58 例，女22 例，年齡42～72 歲，平均年齡（54.69±8.96）歲。 同時(shí)選取同期于本院進(jìn)行體檢的健康志愿者80 例為對(duì)照組， 其中男55例， 女25 例，年齡42～75 歲， 平均年齡（55.69±9.52）歲。 各組受試者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。 本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象知情且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 抽取三組研究對(duì)象入組后的空腹靜脈血5 mL，4 ℃經(jīng)3 000 r/min 離心10 min，吸取上清，置于-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR) 檢測(cè)血清circ_0009128的表達(dá)水平 采用Trizol 法（美國(guó)Invitrogen 公司）提取血清中的總RNA， 應(yīng)用Nanodrop2000c 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度與純度。 參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，circ_0009128 正 向 引 物5’-CTGGCTCAATTGCTCACTGA-3’，反向引物5’-CCTCAAATGATCTGCCTGCC-3’；GAPDH 正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’， 反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’， 引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。 以cDNA 為模板進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)，qRT-PCR 反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL， 正 反 向 引 物 各1 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μL； 反應(yīng)條件：95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s（循環(huán)40 次）。 circ_0009128 以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0009128 相對(duì)表達(dá)量。 反轉(zhuǎn)錄試劑盒與qRT-PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2.3 檢測(cè)血清炎癥因子水平 采用酶聯(lián)免疫吸附法 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）的水平，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司， 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.4 檢測(cè)血清氧化應(yīng)激指標(biāo) 采用硫代巴比妥酸比色法檢出血清過(guò)氧化脂質(zhì)（lipoperoxides，LPO）水平， 采用氮藍(lán)四唑法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。 采用改良的Hafeman 氏法檢測(cè)血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）水平，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海盈公酶聯(lián)檢測(cè)試劑有限公司， 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.5 評(píng)估患者肺部感染程度 采用肺部感染評(píng)分（Clinical Pulmonary Infection Score，CPIS）評(píng)估患者肺部感染程度，分?jǐn)?shù)越高預(yù)示肺部感染越嚴(yán)重[9]。

1.2.6 檢測(cè)TLR4 水平與免疫球蛋白水平 采用ELISA 法檢測(cè)血清Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）水平，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京方程佰金科技有限公司。采用免疫比濁法檢測(cè)血清免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）、 免 疫 球 蛋 白G （Immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）水平，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；采用Pearson 法分析重癥肺炎患者circ_0009128 與炎癥因子、 氧化應(yīng)激、CPIS 評(píng)分、TLR4、免疫蛋白的相關(guān)性，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重癥肺炎患者血清circ_0009128 表達(dá)量 與對(duì)照組比較， 普通肺炎組、 重癥肺炎組血清circ_0009128 的表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）；與普通肺炎組比較， 重癥肺炎組血清circ_0009128 的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 重癥肺炎患者血清circ_0009128 表達(dá)量比較（±s）

表1 重癥肺炎患者血清circ_0009128 表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與普通肺炎組比較，#P<0.05。

組別 n對(duì)照組普通肺炎組重癥肺炎組80 80 90 F P circ_0009128 1.01±0.20 0.72±0.11*0.41±0.13*#335.969 0.000

2.2 重癥肺炎患者血清炎癥因子水平比較 與對(duì)照組比較，普通肺炎組、重癥肺炎組血清IL-6、IL-18、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與普通肺炎組比較，重癥肺炎組血清IL-6、IL-18、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 重癥肺炎患者血清炎癥因子水平比較（±s，ng/L）

表2 重癥肺炎患者血清炎癥因子水平比較（±s，ng/L）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與普通肺炎組比較，#P<0.05。

組別 n對(duì)照組普通肺炎組重癥肺炎組80 80 90 F P IL-6 IL-18 38.95±12.03 63.24±13.12*86.57±10.03*#349.180 0.000 50.32±13.25 76.35±10.02*96.57±13.20*#300.323 0.000 TNF-α 33.25±9.86 63.21±10.13*98.57±11.24*#830.925 0.000

2.3 重癥肺炎患者血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，普通肺炎組、重癥肺炎組血清LPO 水平顯著升高 （P＜0.05），SOD、GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.05）； 與普通肺炎組比較， 重癥肺炎組血清LPO 水平顯著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 重癥肺炎患者血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

表3 重癥肺炎患者血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與普通肺炎組比較，#P<0.05。

組別 n對(duì)照組普通肺炎組重癥肺炎組80 80 90 F P LPO（μmol/L） SOD（U/L）10.20±1.23 15.52±1.03*20.03±5.20*#193.693 0.000 485.25±36.24 356.21±22.03*186.34±20.12*#2655.865 0.000 GSH-Px（U/L）126.35±12.45 95.32±10.15*45.32±9.23*#1261.870 0.000

2.4 重癥肺炎患者CPIS 評(píng)分比較 與普通肺炎組比較，重癥肺炎組CPIS 評(píng)分顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 重癥肺炎患者CPIS 評(píng)分比較（±s）

表4 重癥肺炎患者CPIS 評(píng)分比較（±s）

注：與普通肺炎組比較，*P<0.05。

組別 n普通肺炎組重癥肺炎組80 90 t P CPIS 評(píng)分5.16±1.45 6.23±1.32*5.036 0.000

2.5 重癥肺炎患者血清TLR4 水平與免疫蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，普通肺炎組、重癥肺炎組血清TLR4 水平顯著升高（P＜0.05），血清IgA、IgG、IgM 水平顯著降低（P＜0.05）；與普通肺炎組比較，重癥肺炎組血清TLR4 水平顯著升高（P＜0.05），血清IgA、IgG、IgM 水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 重癥肺炎患者血清TLR4 水平與免疫蛋白水平比較（±s）

表5 重癥肺炎患者血清TLR4 水平與免疫蛋白水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與普通肺炎組比較，#P<0.05。

組別 n TLR4（ng/mL） IgA（g/L） IgG（g/L） IgM（g/L）對(duì)照組普通肺炎組重癥肺炎組80 80 90 F P 3.26±1.01 6.54±1.15*8.58±1.10*#510.603 0.000 1.96±0.21 0.52±0.11*0.32±0.10*#3051.622 0.000 12.30±2.12 6.54±1.03*4.12±0.85*#722.852 0.000 1.35±0.12 1.10±0.09*0.68±0.06*#1154.329 0.000

2.6 circ_0009128 與炎癥因子、 氧化應(yīng)激、CPIS 評(píng)分、TLR4、 免疫蛋白的相關(guān)性分析 采用Pearson法分析重癥肺炎患者circ_0009128 與炎癥因子、氧化應(yīng)激、CPIS 評(píng)分、TLR4、 免疫蛋白的相關(guān)性，結(jié)果顯示circ_0009128 與SOD、GSH-Px、IgA、IgG、IgM 呈正相關(guān)（P＜0.05），而與IL-6、IL-18、TNF-α、LPO、CPIS 評(píng)分、TLR4 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 circ_0009128 與炎癥因子、氧化應(yīng)激、CPIS 評(píng)分、TLR4、免疫蛋白的相關(guān)性分析（r/p）

3 討論

circRNA 在自身免疫性疾病、炎癥性疾病中表達(dá)異常并可能參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[10-11]。但circ_0009128 在重癥肺炎中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚未闡明。 本研究結(jié)果顯示重癥肺炎患者血清circ_0009128 的表達(dá)水平顯著降低，其表達(dá)量顯著低于普通肺炎患者及對(duì)照組， 提示circ_0009128在重癥肺炎發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激在肺炎發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中IL-6、IL-18、TNF-α 可參與機(jī)體炎癥反應(yīng)， 并可促使患者肺部受損而引發(fā)重癥肺炎，LPO 屬于氧自由基與多聚不飽和脂肪酸的反應(yīng)產(chǎn)物且具有促進(jìn)氧化應(yīng)激的作用，SOD、GSH-Px 是過(guò)氧化物分解酶， 可提高機(jī)體抗氧化能力[12-13]。 本研究結(jié)果顯示重癥肺炎患者血清中IL-6、IL-18、TNF-α、LPO 水平顯著升高， 血清中SOD、GSH-Px 活性顯著降低， 與上述研究報(bào)道結(jié)果相似，說(shuō)明重癥肺炎患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)加重，且患者存在氧化/抗氧化失衡， 即重癥肺炎患者存在氧化應(yīng)激反應(yīng)。 本研究結(jié)果顯示重癥肺炎患者CPIS 評(píng)分顯著高于普通肺炎組患者， 提示重癥肺炎患者肺部感染情況明顯加重。 本研究采用Pearson 法分析顯示circ_0009128 與SOD、GSH-Px呈正相關(guān)，而與IL-6、IL-18、TNF-α、LPO、CPIS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)， 提示circ_0009128 與重癥肺炎患者炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。

重癥肺炎病情發(fā)展可引起多臟器功能障礙綜合征，而病原菌感染是引發(fā)肺炎的重要原因，TLRs信號(hào)通路可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子生成從而激發(fā)炎癥反應(yīng)，TLR4 可與其配體結(jié)合而促進(jìn)炎癥因子釋放從而引發(fā)炎癥反應(yīng)[14-17]。研究表明免疫球蛋白IgA、IgG、IgM 與肺炎患者免疫功能密切相關(guān)，肺炎患者血清中IgA、IgG、IgM 水平顯著降低[18-21]。 本研究結(jié)果顯示重癥肺炎患者血清TLR4 水平顯著升高，IgA、IgG、IgM 水平顯著降低， 與上述研究報(bào)道結(jié)果相似， 提示重癥肺炎患者體內(nèi)存在細(xì)胞免疫功能失調(diào)。 同時(shí)本研究結(jié)果顯示circ_0009128 與IgA、IgG、IgM 呈正相關(guān)， 而與TLR4 呈負(fù)相關(guān)， 提示circ_0009128 與重癥肺炎患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。 分析原因可能為circ_0009128 表達(dá)降低可引發(fā)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)， 炎癥反應(yīng)可加重患者肺部損傷程度還可影響機(jī)體免疫功能從而導(dǎo)致機(jī)體抵抗能力降低最終加重肺部感染嚴(yán)重程度。

綜上所述， 重癥肺炎患者血清circ_0009128的表達(dá)水平顯著降低， 炎癥因子、LPO、TLR4 水平升高，SOD、GSH-Px 活性與IgA、IgG、IgM 水平顯著降低，circ_0009128 與炎癥反應(yīng)、 氧化應(yīng)激及免疫功能密切相關(guān)，circ_0009128 表達(dá)量降低與重癥肺炎發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)， 并可能作為重癥肺炎診斷及判斷病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。 本研究首次檢測(cè)重癥肺炎患者血清circ_0009128 的表達(dá)水平， 并初步分析其與疾病嚴(yán)重程度及病情發(fā)展的相關(guān)性，但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。