TCERG1L 在乳腺癌中的表達(dá)及其與ERα 的相互調(diào)控

吳羅燕，周斌，葉東梅，何崇武，程波，鄔黎青

（1.南昌市第一醫(yī)院病理科 南昌大學(xué)研究生院，江西 南昌 330008； 2.江西省迪安華星醫(yī)學(xué)檢驗實驗室，江西 南昌 330072；3.江西省腫瘤醫(yī)院乳腺外科，江西 南昌 330029；4.九江市第三人民醫(yī)院病理科，江西 九江 332000）

乳腺癌的發(fā)生是一個多步驟的過程。 一般認(rèn)為乳腺癌的發(fā)展模式是： 組織學(xué)正常的乳腺上皮發(fā)展為平坦上皮非典型增生(Flat Epithelial Atypia,FEA)非典型導(dǎo)管上皮增生(Atypical Ductal Hyperplasia, ADH)和導(dǎo)管原位癌(DCIS)，進(jìn)而發(fā)展為浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)[1]。 DCIS 并不代表IDC 的早期階段，IDC 可以從DCIS 發(fā)展而來， 也可以從其他途徑進(jìn)展而來，包括直接從腫瘤干細(xì)胞演變而來。 乳腺癌是女性最常見的癌癥，發(fā)病率約為30%，死亡率在女性所有惡性腫瘤中位居第二[2-3]。 當(dāng)前的治療方法旨在通過闡明腫瘤發(fā)生的分子機制及早期發(fā)展階段來預(yù)防腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。 人們普遍接受腫瘤的發(fā)生是由多個體細(xì)胞突變導(dǎo)致的[4-7]。 在健康細(xì)胞中， 腫瘤抑制因子和癌基因的失調(diào)會導(dǎo)致表型轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。 最近，研究表明腫瘤發(fā)生過程出現(xiàn)基因異常修飾的作用[8]。 其中，CpG 島的高甲基化是癌癥最早和最頻繁的變化之一[9]。

轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)節(jié)因子1-like（TCERG1L）位于10號染色體，調(diào)節(jié)DNA 轉(zhuǎn)錄、延伸和mRNA 剪接[10-11]。TCERG1L 于2010年被首次報告，因為其異常與兒童的精神集中障礙有關(guān)。隨后，TCERG1L 基因的幾種突變形式在非腫瘤性疾病中被發(fā)現(xiàn)，包括肥胖、炎癥和糖尿病。 相關(guān)[12]報道，TCERG1L 在潰瘍性結(jié)腸炎、 結(jié)腸癌和癌前病變中失表達(dá)是由其啟動子的CpG 甲基化所致，這表明TCERG1L 的失表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生、 發(fā)展存在相關(guān)性， 提示TCERG1L在結(jié)腸癌中起著抑癌作用。

本研究中，我們檢測TCERG1L 在正常的乳腺上皮細(xì)胞、DCIS 和IDC 細(xì)胞中的表達(dá)，并探究其與ERα 表達(dá)和其他臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。 我們發(fā)現(xiàn)TECRG1L 在正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和乳腺良性病變的導(dǎo)管上皮細(xì)胞中高表達(dá)。 然而，TECRG1L 在DCIS 和IDC 細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，并且與ERα 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明，TCERG1L低表達(dá)是ERα 陽性IDC 的特征之一，可作為ERα的IDC 的病理診斷生物標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 樣本資料 收集南昌市第一醫(yī)院及江西省迪安華星醫(yī)學(xué)檢驗實驗室2006年1月至2013年9月石蠟包埋的乳腺組織樣本181 例，包括60 例乳腺良性病變（腺瘤、纖維腺瘤、導(dǎo)管擴(kuò)張和纖維性囊性乳腺疾病），年齡18～62 歲（平均40.1 歲）；61 例DCIS 組織，年齡36～63 歲 （平均47.2 歲）；60 例IDC 組織，年齡29～73 歲（平均53.1 歲）及其相對應(yīng)的鄰近正常乳房組織。 根據(jù)2019 版乳腺WHO對DCIS 的組織學(xué)分類，低級別DCIS 7 例，中級別DCIS 20 例，高級別DCIS 34 例。 根據(jù)IDC 的組織學(xué)分類，I 期16 例，II 期33 例，III 期11 例。所有標(biāo)本均經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)， 并獲得參與本研究所有患者的知情同意。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 兔抗人TCERG1L 多克隆抗體（1:80 稀釋）和兔抗人ERα 多克隆抗體（1∶500稀釋）購自Abcam。HRP 偶聯(lián)的二抗購自北京中山金橋公司（1∶200 稀釋）。 免疫組織化學(xué)檢測試劑盒和增強型DBA 顯影劑購自廣州勝達(dá)生物制劑公司。 將樣本固定在10%福爾馬林中，石蠟包埋，并以3 μm 切片，烤片、脫蠟后按免疫組化說明書進(jìn)行免疫組化染色，封片后于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀 TCERG1L 陽性染色定位于核上， 在高分辨率光學(xué)顯微鏡下對每個樣品連續(xù)計數(shù)五個視野。 使用半定量分級進(jìn)行分析。 根據(jù)染色強度對染色結(jié)果進(jìn)行評分， 未著色評分為0，淺黃色為1 分，淺棕色為2 分，深褐色為3 分。 根據(jù)陽性染色細(xì)胞的百分比評估：陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)比例<25%得分為1，25%～49%得分 為2，50%～75%得 分 為3，>75% 得 分 為4。TCERG1L 在細(xì)胞染色強度和所占百分比的總分相加：0～2 為 陰 性/（-），3～4 為 弱 陽/（+），5 為 陽 性/（++），6～7 為強陽性/（+++）。 陽性/（++） 和強陽性/（+++）的病例數(shù)除以病例總數(shù)；陰性染色率即弱陽性染色/（+）和陰性染色/（-）病例數(shù)除以總病例數(shù)得出。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDAMB-231 和正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100，均來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海研究所。 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 按照我們之前的研究，每兩天更換一次培養(yǎng)基[14]。

1.4 免疫印跡分析 收集人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231 和正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100，提取細(xì)胞總蛋白，并裂解，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液后變性5 min，通過SDS-PAGE 電泳分離。 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，封閉液封閉1.5 h，并在4℃冰箱孵育β-actin（1∶2 000）和TCERG1L（1∶500）抗體過夜。 將膜放入TBST 中漂洗，室溫孵育含HRP 的二抗（1∶2 000） 2 h，洗滌并顯影。

1.5 統(tǒng)計分析 運用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果。 卡方檢驗分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；Western blot 實驗數(shù)據(jù)運用One-way ANOVA 做統(tǒng)計分析，P<0.05 和P<0.01 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCERG1L 在乳腺癌組織低表達(dá) 為了觀察乳腺癌組織和正常乳腺上皮、 乳腺良性病變TCERG1L 表達(dá)的差異， 我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色評估了60 例IDC 組織、61 例DCIS 組織和60 例乳腺良性病變組織中TCERG1L 的表達(dá)。TCERG1L陽性染色定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，見圖1。TCERG1L在IDC 陽性染色率為63.4%，癌旁正常乳腺上皮細(xì)胞陽性率83.3%；DCIS 中TCERG1L 陽性染色率為73.8%，DCIS 旁正常乳腺上皮細(xì)胞陽性率90.2%；乳腺良性病變中正常的乳腺上皮細(xì)胞TCERG1L陽性率90%， 見表1。 與正常乳腺組織相比，TCERG1L 在DCIS 和IDC 中的表達(dá)顯著降低，但TCSRG1L 在DCIS 與IDC 癌旁正常乳腺組織與乳腺良性病變中正常乳腺組織中表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果表明TCERG1L 在正常乳腺上皮細(xì)胞中高表達(dá)，但在DCIS 和IDC 細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。

圖1 TCERG1L 蛋白在乳腺組織中的表達(dá)

表1 TCERG1L 蛋白在乳腺良性病變、原位導(dǎo)管癌和浸潤性導(dǎo)管癌及癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)

2.2 ERα 抑制TCERG1L 在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)本研究購買的乳腺癌MCF-7 細(xì)胞陽性表達(dá)ERα，而MDA-MB-231 細(xì)胞不表達(dá)ERα，正常乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)ERα 和TCERG1L。 TCERG1L 在ERα 陽性表達(dá)的HBL-100 細(xì)胞和ERα 陰性表達(dá)的MDA-MB-231 細(xì)胞中高表達(dá)， 而在ERα 陽性的MCF-7 細(xì)胞中表達(dá)顯著減弱， 見圖2。結(jié)果提示ERα 的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞中TCERG1L 的表達(dá)，但不削弱TCERG1L 在正常上皮細(xì)胞HBL-100 中的表達(dá)。 隨后結(jié)合臨床病例資料我們分析了TCERG1L 在IDC 中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，見表2。結(jié)果顯示，IDC 細(xì)胞中TCERG1L 表達(dá)與ERα 呈負(fù)相關(guān) （P=0.005）， 而與PR 表達(dá)無關(guān)（P=0.082）。 IDC 細(xì) 胞 中 的TCERG1L 的 表 達(dá) 與CerbB-2 或Ki-67 表達(dá)水平無關(guān)（P>0.05），并與腫瘤塊的大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和患者年齡無關(guān)。

圖2 Western blot 檢測TCERG1L 在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、MCF-7 細(xì)胞和正常乳腺上皮HBL-100 細(xì)胞中的表達(dá)

表2 浸潤性導(dǎo)管癌中TCERG1L 蛋白與ERα 表達(dá)及與其他臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

轉(zhuǎn)錄延長調(diào)節(jié)因子1-like (TCERG1L)類似于轉(zhuǎn)錄延長調(diào)節(jié)因子1 (TCERG1)，可以調(diào)節(jié)DNA 的轉(zhuǎn)錄、延長和mRNA 的剪接[11]。TCERG1 使RNA 聚合酶II 羧基末端結(jié)構(gòu)域（CTD）中的蘇氨酸磷酸化以增強基因轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)基因 （包括Bclx）[11,13]。 我們發(fā)現(xiàn)TCERG1L 在正常的導(dǎo)管上皮細(xì)胞核中陽性表達(dá)，但在DCIS 和IDC 細(xì)胞中表達(dá)明顯降低。TCERG1L 陰性表達(dá)可能是由于DNA 甲基化或LncRNA 靶向?qū)е碌霓D(zhuǎn)錄活性喪失所致。 翻譯后修飾引起的加速降解和ERα 的直接降解作用也不能被忽視。

CpGs 的高甲基化被認(rèn)為是癌癥轉(zhuǎn)化過程中最早和最頻繁的變化之一[14-15]，并被認(rèn)為可以促進(jìn)基因沉默。 基因突變可導(dǎo)致TCERG1L 的低甲基化，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TCERG1L 在潰瘍性結(jié)腸炎[13]和結(jié)腸癌[16]中高甲基化。 在健康細(xì)胞中，腫瘤抑制基因和癌基因之間存在著一種平衡。 當(dāng)這種平衡被破壞，癌基因占主導(dǎo)地位時， 細(xì)胞就會轉(zhuǎn)化為發(fā)育不良細(xì)胞或癌細(xì)胞。

在這項研究中， 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示TECRG1L 在正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和乳腺良性病變的導(dǎo)管上皮細(xì)胞中高表達(dá)，但在DCIS 和IDC 細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低。 TECRG1L 表達(dá)水平的變化原因可能是由于細(xì)胞周期不同階段或整個細(xì)胞系中ERα 表達(dá)的改變造成。由于并非所有的DCIS細(xì)胞都直接來源于正常的導(dǎo)管上皮細(xì)胞， 有些源于非典型上皮細(xì)胞，DCIS 表現(xiàn)出異質(zhì)性，從而影響細(xì)胞生物學(xué)行為[17]。 此外，IDC 源于DCIS，但某些IDC 源于干細(xì)胞。 IDC 細(xì)胞顯示出多變的形態(tài)，且并非全部細(xì)胞表達(dá)相同水平的TECRG1L 或ERα，導(dǎo)致變異。

正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞TECRG1L 高表達(dá)，但TECRG1L 在DCIS 和IDC 細(xì)胞表達(dá)上水平顯著降低，提示TCERG1L 是腫瘤抑制因子。 TCERG1L 在IDC 細(xì)胞中的表達(dá)水平與ERα 呈負(fù)相關(guān)， 表明直接或間接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)的相互作用。 以往研究表明，ERα 通過slug 調(diào)控E-鈣黏蛋白和EMT[18]。ERα 也可能直接或間接促進(jìn)TCERG1L 甲基化?？傊?我們的研究表明，ERα 陽性 的乳 腺IDC 中TCERG1L 表達(dá)顯著降低， 當(dāng)診斷有困難時，TCERG1L 是個有用的生物標(biāo)記物。TCERG1L 表達(dá)顯著降低應(yīng)優(yōu)先考慮IDC。 ERα 和TECRG1L 相互調(diào)控的機制尚需進(jìn)一步探究。