選擇性剪接事件預(yù)測急性髓系白血病患者生存并揭示免疫微環(huán)境特征

黃玉娟，鐘芳敏，周莉，黃波，王小中，李靜

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006）

急性髓系白血病（AML)是一類以骨髓和外周血中未成熟骨髓干/祖細(xì)胞惡性增殖為特征的惡性腫瘤。 目前，該病的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，表觀遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析揭示了許多AML 發(fā)生發(fā)展的影響因素[1]。AML 的發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，在老年人中最常見[2]。目前，AML 患者治療仍不樂觀，五年生存率低于30%，高度異質(zhì)性和復(fù)雜的突變分型是AML 精準(zhǔn)治療中極大的挑戰(zhàn)。 因此，進(jìn)一步分析AML 患者分子生物學(xué)特征， 對AML診斷、治療和預(yù)后評估非常重要。

人體系統(tǒng)錯(cuò)綜復(fù)雜且精密， 為應(yīng)對生理環(huán)境的變化和生理過程的需要， 可變剪接發(fā)揮了巨大作用。 各種類型基因轉(zhuǎn)錄本和相應(yīng)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生調(diào)控著細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育[3]，使得機(jī)體活動(dòng)有序地進(jìn)行。 可變剪接通過七種剪接方式對前體mRNA（pre-mRNA）進(jìn)行加工，各類剪接因子相互配合產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)錄本。 但任何生理活動(dòng)都會(huì)存在一定的誤差和障礙，選擇性剪接也不例外。 隨著研究的深入，越來越多的研究表明，異常的選擇性剪接（AS）事件影響著癌癥的發(fā)生發(fā)展。 腫瘤細(xì)胞控制著選擇性剪接的調(diào)控， 產(chǎn)生相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本使自身處于有利的生存狀態(tài)， 并抑制機(jī)體免疫功能對殺傷活性。 因此，對AML 中AS 事件進(jìn)行全面分析具有重要的生物學(xué)意義[4-7]。

隨著高通量測序技術(shù)的成熟與發(fā)展， 人們通過基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的相關(guān)測序可以全面、直觀地分析癌癥細(xì)胞中的變化[8-9]。 AS 事件作為轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序的內(nèi)容之一，具有極高的研究價(jià)值，不同的選擇性剪接類型、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量的異常變化，剪接異構(gòu)體的形成， 在豐度和結(jié)構(gòu)層面都蘊(yùn)含著大量的生物學(xué)信息[10]。生物信息學(xué)分析可以鑒定出癌細(xì)胞中特異的剪接因子調(diào)控方式和轉(zhuǎn)錄本變化。

本研究將生物信息學(xué)分析方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序數(shù)據(jù)中，結(jié)合臨床信息，探索AS 事件之間的關(guān)聯(lián)及與AML 患者預(yù)后、 腫瘤微環(huán)境的關(guān)系。剪接因子（SFs）在選擇性剪接中發(fā)揮了重要作用，AS 事件與剪接因子相關(guān)性分析能更全面了解AML 中AS 事件發(fā)生的特征，根據(jù)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)也有利于發(fā)現(xiàn)隱藏在剪接因子調(diào)控下的AML 病理發(fā)生機(jī)制。 這些互作關(guān)系和預(yù)后分析也將為AML 分子機(jī)制研究和臨床預(yù)后判斷提供參考價(jià)值。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 AML 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和AS 數(shù)據(jù)分別下載于TCGA 和TCGA SpliceSeq 數(shù)據(jù)庫，剪接百分比（PSI）值（0%～100%）記錄每個(gè)AS 事件的發(fā)生情況。 為使得數(shù)據(jù)分析更加嚴(yán)謹(jǐn)和準(zhǔn)確，我們篩選了PSI 值≥75%的樣本進(jìn)行后續(xù)分析。 同時(shí)，我們從TCGA 數(shù)據(jù)庫獲得這部分病人的臨床信息，包含了生存相關(guān)的隨訪記錄。 我們同樣篩選了其中生存時(shí)間≥90 d 的AML 患者，更有利于評估患者的生存及預(yù)后。

1.2 生存分析及預(yù)后相關(guān) AS 事件基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)采用單變量Cox 回歸分析篩選與AML 患者預(yù)后顯著相關(guān)的AS 事件（P＜0.05）。 我們將相應(yīng)的基因輸入到檢索相互作用基因(STRING)數(shù)據(jù)庫的搜索工具中，構(gòu)建的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)由cytoscape 軟件調(diào)整。

1.3 預(yù)后模型構(gòu)建 我們對單變量Cox 分析中篩選的預(yù)后AS 事件進(jìn)一步通過最小收縮與選擇算子（LASSO）回歸分析開發(fā)最優(yōu)風(fēng)險(xiǎn)評分模型。通過模型AS 事件的PSI 值與LASSO 回歸分析指定的系數(shù)相乘，計(jì)算患者的風(fēng)險(xiǎn)評分。 根據(jù)所有患者風(fēng)險(xiǎn)評分的中值， 將所有患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。 然后，使用卡普蘭·邁耶（K-M）曲線對高、低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行生存分析。受試者工作特征曲線（ROC）分析評估預(yù)后模型的準(zhǔn)確性。 單因素、多因素獨(dú)立預(yù)后分析判斷模型風(fēng)險(xiǎn)評分的獨(dú)立預(yù)測能力。

1.4 基于風(fēng)險(xiǎn)評分分組的免疫微環(huán)境、免疫評分分析 單樣本基因集富集分析量化了29 個(gè)免疫標(biāo)記的富集水平， 通過分析相應(yīng)表征基因的表達(dá)水平進(jìn)一步評估患者的免疫浸潤特點(diǎn)。ESTIMATE 分析風(fēng)險(xiǎn)評分與免疫微環(huán)境的關(guān)系。

1.5 SF-AS 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 在以前的研究中整理得到了404 個(gè)SFs。 我們根據(jù)SFs 的表達(dá)值與預(yù)后相關(guān)的AS 事件的PSI 值構(gòu)建SF-AS 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，條件如下：P<0.001，皮爾遜（Pearson）相關(guān)系數(shù)的絕對值大于0.6。 然后，我們通過Cytoscape 軟件建立了相關(guān)性圖。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)獲取及AML 患者預(yù)后相關(guān)AS 事件鑒定我們對151 名AML 患者的選擇性剪接數(shù)據(jù)、RNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，共有8830 個(gè)基因參與了34 984 個(gè)AS 事件。 七種剪接模式包括外顯子跳躍(es)、互斥外顯子(ME)、保留內(nèi)含子(RI)、替代啟動(dòng)子(AP)、替代終止子(AT)、替代供體位點(diǎn)(AD)和替代受體位點(diǎn)(AA)，見圖1a。對AS 事件進(jìn)行cox回歸分析，我們得到了6 504 個(gè)基因在內(nèi)的18 099個(gè)預(yù)后相關(guān)AS 事件， 這些AS 事件根據(jù)不同的剪接類型進(jìn)一步分類。 一個(gè)基因可能參與兩個(gè)或兩個(gè)以上與AML 病患者生存顯著相關(guān)的AS 事件,這些AS 事件繪制成upset 圖可以直觀清晰地進(jìn)行比較，見圖1b。

圖1 AML 患者預(yù)后相關(guān)AS 事件的鑒定

2.2 預(yù)后顯著相關(guān)選擇性剪接事件及分子特征火山圖顯示AML 患者預(yù)后相關(guān)AS 事件的整體分布情況，見圖2a，紅色部分表示與生存顯著相關(guān)的AS 事件，綠色部分表示相關(guān)性不顯著。泡泡圖顯示七種剪接模式下AML 患者預(yù)后最相關(guān)的事件，見圖2b—圖2h。

圖2 AML 患者預(yù)后相關(guān)AS 事件以及每種剪接類型下最顯著相關(guān)事件的可視化情況

2.3 AML 患者的預(yù)后特征 對單變量Cox 分析所得與患者預(yù)后顯著相關(guān)的AS 事件進(jìn)行LASSO 回歸分析，去除冗余基因以防止模型的過度擬合，增加模型構(gòu)建的穩(wěn)定性，見圖3a—圖3b。進(jìn)一步通過多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)分析，我們構(gòu)建了一個(gè)包含6個(gè)預(yù)后相關(guān)AS 事件風(fēng)險(xiǎn)評分模型。計(jì)算所有AML患者風(fēng)險(xiǎn)評分，我們依據(jù)評分中位數(shù)將AML 患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組。 K-M 曲線分析顯示高風(fēng)險(xiǎn)組患者預(yù)后更差，見圖3c。 風(fēng)險(xiǎn)評分曲線依據(jù)評分中位數(shù)將AML 患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，見圖3d。 生存狀態(tài)圖顯示，隨著風(fēng)險(xiǎn)評分的增加，患者死亡數(shù)也相應(yīng)增加，表明風(fēng)險(xiǎn)評分與生存狀態(tài)有關(guān)，見圖3e。 熱圖顯示了高低風(fēng)險(xiǎn)評分患者AS 事件PSI 值的總體情況，見圖3f。 ROC 曲線分析表明模型具有較高的準(zhǔn)確性（1年、3年、5年生存期AUC 值分別為0.822、0.852、0.838），與其他臨床指標(biāo)相比能更準(zhǔn)確地預(yù)測患者的預(yù)后， 見圖3g—圖3h。 單變量和變量獨(dú)立預(yù)后分析中風(fēng)險(xiǎn)評分P 值均＜0.05，風(fēng)險(xiǎn)評分可作為臨床預(yù)測AML 患者生存狀況的獨(dú)立預(yù)后因素，見圖3i—圖3j。

圖3 AML 患者預(yù)后模型構(gòu)建

2.4 免疫微環(huán)境與風(fēng)險(xiǎn)評分密切相關(guān) 高風(fēng)險(xiǎn)組免疫細(xì)胞浸潤水平和免疫評分比低風(fēng)險(xiǎn)組更高，見圖4a—圖4b。 一般來說， 患者腫瘤惡性程度越高，刺激機(jī)體免疫功能的激活，免疫浸潤水平也越高，相應(yīng)的免疫評分也越高。

圖4 高、低風(fēng)險(xiǎn)評分組免疫微環(huán)境的區(qū)別

2.5 生存相關(guān)的SF-AS 網(wǎng)絡(luò)AS 事件主要由通過與pre-mRNA 結(jié)合并影響外顯子選擇性剪接位點(diǎn)調(diào)節(jié)RNA 剪接的SF 進(jìn)行調(diào)控。 因此，在AML 中探索SFs 與AS 關(guān)系非常重要。 我們將相應(yīng)SFs 的表達(dá)與生存最顯著相關(guān)AS 事件的PSI 值 （P<0.001）進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，見圖5。 我們觀察到QKI 作為核心分子在網(wǎng)絡(luò)中的連接程度最高。

圖5 AML 患者SF-AS 網(wǎng)絡(luò)及生存分析

3 討論

Pre-mRNA 經(jīng)選擇性剪接修飾生成成熟mRNA 是真核生物轉(zhuǎn)錄過程中必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)[11]，在基因表達(dá)的源頭上產(chǎn)生了重要的影響， 不同的選擇性剪接方式可以產(chǎn)生不同的基因轉(zhuǎn)錄本，異常調(diào)節(jié)下游靶基因或信號通路的作用， 使得癌細(xì)胞的功能產(chǎn)生變化，進(jìn)而影響疾病的表型。 這一類變化不局限于轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量的改變， 更是在于結(jié)構(gòu)水平上的不同， 結(jié)構(gòu)水平能更直觀表現(xiàn)基因作用位點(diǎn)的差異性，具有較強(qiáng)的說服力，因此選擇性剪接事件作為分子標(biāo)志物具有廣闊的應(yīng)用前景。在本研究中，我們以AML 為研究對象，綜合利用了多種醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，將AML 患者的選擇性剪接事件發(fā)生情況和相應(yīng)的臨床信息進(jìn)行整合， 構(gòu)建可評估AML 患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的選擇性剪接事件模型。 此外，從SFs-AS 網(wǎng)絡(luò)的角度可進(jìn)一步了解選擇性剪接推動(dòng)因素，為AML 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供進(jìn)一步的見解。 目前研究表明，可變剪接事件有可能作為腫瘤學(xué)中新的生物標(biāo)志物， 并且為藥物的開發(fā)提供大量新靶點(diǎn)[12]，這對于改善癌癥患者預(yù)后和減少癌癥異質(zhì)性來說非常有意義。

本研究通過LASSO 回歸分析構(gòu)建了與AML患者預(yù)后相關(guān)的AS 事件預(yù)后模型， 通過這個(gè)模型，我們能有效地預(yù)測AML 患者預(yù)后。 此外，我們也發(fā)現(xiàn)高低風(fēng)險(xiǎn)組的腫瘤微環(huán)境具有差異。 高風(fēng)險(xiǎn)組免疫細(xì)胞浸潤水平和免疫評分更高。 這些內(nèi)容從理論上為AML 分子生物學(xué)研究和臨床預(yù)后判斷提供了參考價(jià)值。 但這項(xiàng)研究的局限在于完全的生物信息學(xué)分析， 缺乏新的AML 患者AS 數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。 未來我們將結(jié)合臨床病人數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證， 并針對這一系列AS 事件開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步強(qiáng)化AML 中選擇性剪接調(diào)控的研究。

最后，我們將目光聚集到SFs 上，作為剪接調(diào)控的工具，這些分子在形成大量AS 事件的過程中發(fā)揮了巨大作用[12]。 強(qiáng)化認(rèn)識SFs 在AML 異常AS事件中的功能， 是解開AML 以AS 為方向的病理機(jī)制的關(guān)鍵一步。 越來越多的研究表明，SFs 的變化可以通過多種機(jī)制參與AML 的發(fā)生和發(fā)展[13]。我們繪制的AS-SF 網(wǎng)絡(luò)圖顯示QKI 位于網(wǎng)絡(luò)的中心，QKI 是RNA(STAR)家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活的成員，也屬于異質(zhì)核核蛋白K-(hnRNP K-)同源結(jié)構(gòu)域蛋白家族。QKI 在許多腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展中都具有調(diào)控作用， 如QKI 通過RAS p21 蛋白激活劑1/絲裂原活化蛋白激酶（RASA1/MAPK）信號通路抑制乳腺癌[14]，調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1α)的表達(dá)抑制腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生[15]，巨噬細(xì)胞中QKI 的丟失通過擴(kuò)增活性氧（ROS）信號和微生物群的破壞加劇炎癥性腸病[16]。這些表明QKI 在癌癥發(fā)展中起到了重要作用，但在AML 中未見報(bào)道，未來可針對該分子進(jìn)一步研究其與AML 的關(guān)系。

本研究揭示了AML 患者中預(yù)后相關(guān)AS 事件，進(jìn)一步認(rèn)識了AML 中的AS 特征，此外，我們通過AS 事件構(gòu)建的預(yù)后模型具有較準(zhǔn)確的預(yù)后預(yù)測能力。 最后，我們也分析了模型高低風(fēng)險(xiǎn)組患者免疫微環(huán)境的特征， 并構(gòu)建了SFs-AS 網(wǎng)絡(luò)， 這一部分內(nèi)容為我們針對AML 免疫治療和后續(xù)AML 剪接機(jī)制研究提供了線索。