毛細支氣管炎患兒單核細胞TLR4、淋巴細胞CXCR3及血清Mig的表達及臨床意義

付亞妮，湯勉

寶雞市婦幼保健院兒童呼吸科1、兒童重癥科2，陜西 寶雞 721000

毛細支氣管炎是高發(fā)于嬰幼兒的一種下呼吸道感染疾病，多為病毒感染引起[1-2]。有研究表明，毛細支氣管炎發(fā)展到嚴重階段時可使患兒高頻率喘息，進展為哮喘的概率大大增加[3]。免疫細胞、細胞因子和趨化因子等均參與了毛細支氣管炎的發(fā)生發(fā)展。趨化因子是近年來臨床研究的熱點，其受體是G蛋白偶聯(lián)7次跨膜受體的超家族，其與其受體特異性結(jié)合后可發(fā)揮相應(yīng)功能。趨化因子CXCR3是CXC的受體之一，其主要在CD4+T、CD8+T、自然殺傷及樹突等細胞表面存在，屬Th1大類受體，介導一系列炎癥反應(yīng)[4-6]。CXCR3及其配體血清單核細胞趨化因子(Mig)參與了腫瘤、病毒感染性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)等的免疫反應(yīng)，其在免疫調(diào)節(jié)方面的作用已被臨床研究所證實[7]。眾所周知，毛細支氣管炎與哮喘有著密不可分的聯(lián)系，前者發(fā)展到一定程度會誘發(fā)后者，CXCR3及其Mig與哮喘的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[8]，那么其是否在毛細支氣管炎中發(fā)揮相似的作用？目前報道較少。Toll樣受體-4(TLR4)主要表達于單核、巨噬細胞表面，能夠識別病原體，有研究稱，毛細支氣管炎患者外周血TLR4水平顯著較正常者增加，提示TLR4參與了毛細支氣管炎的發(fā)生過程中[9]。本研究檢測毛細支氣管炎患兒外周血淋巴細胞表面CXCR3的表達率及血清中其配體Mig的濃度水平，研究毛細支氣管炎血單核細胞中TLR4表達與CXCR3及其CXCR3的配體Mig水平變化的相關(guān)性，探討毛細支氣管炎可能的發(fā)病機制，為臨床診斷和治療毛細支氣管炎提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2020年5月在寶雞市婦幼保健院治療的110例毛細支氣管炎患兒作為觀察組，根據(jù)呼吸危重評定表(RDAI)評分[10]分為輕中度(RDAI≤8分)患兒65例，重度(RDAI≥9分)患兒45例。納入標準：(1)年齡≤2歲；(2)均為初治患兒；(3)診斷符合《諸福棠實用兒科學》中的標準[11]；(4)患兒監(jiān)護人知情同意。排除標準：(1)研究前1個月內(nèi)有免疫制劑藥物服用史；(2)合并有肝腎功能障礙、自身免疫系統(tǒng)疾病、遺傳代謝性疾病等其他嚴重疾病。110例患兒中男性66例，女性44例；年齡3～15個月，平均(11.28±2.01)個月。同時選取在寶雞市婦幼保健院體檢的健康兒童50例作為對照組，其中男性31例，女性19例；年齡3～18個月，平均(10.88±1.891)個月。觀察組和對照組受檢者的一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 觀察指標與檢測方法 采集所有受試者血樣樣本3 mL。全血樣本用EDTA抗凝管收集，室溫保存，用于TLR4、淋巴細胞CXCR3的檢測。根據(jù)紅細胞裂解液(Lysingbuffer，美國BD Pharm Lyse州公司)說明書裂解紅細胞，按照美國BioLe-gend公司生產(chǎn)的單核細胞TLR4、淋巴細胞CXCR3檢測試劑盒說明書孵育抗體，多聚甲醛固定，用流式細胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)于48 h內(nèi)完成檢測。采用ELISA方法檢測血清Mig水平，ELISA試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)有限公司。繪制標準曲線：先用ST-360型酶標儀(上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司)檢測標準品在90 pg/mL、60 pg/mL、30 pg/mL、15 pg/mL、7.5 pg/mL、0 pg/mL濃度下的OD值，應(yīng)用CurveExPert1.3軟件作圖，以濃度為X軸，OD值為Y軸擬合出標準曲線，計算出其回歸方程式。將所測的樣品的OD值代入方程式中，計算得出樣品濃度，乘以稀釋倍數(shù)，即得待測樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，TLR4、CXCR3和血清Mig的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的TLR4、CXCR3及Mig水平比較 觀察組患兒的TLR4、CXCR3和Mig表達水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的TLR4、CXCR3及Mig水平比較(±s)

表1 兩組受檢者的TLR4、CXCR3及Mig水平比較(±s)

組別觀察組對照組t值P值例數(shù)110 50 TLR4(ng/mL)24.40±4.11 1.20±0.32 39.792 0.001 CXCR3(ng/mL)15.50±3.22 12.01±1.82 7.154 0.001 Mig(pg/mL)108.28±31.18 65.50±19.22 8.951 0.001

2.2 觀察組不同嚴重程度患兒的TLR4、CXCR3及Mig水平比較 觀察組重度組患兒TLR4、CXCR3和Mig表達水平明顯高于輕中度組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 觀察組不同嚴重程度患兒的TLR4、CXCR3及Mig水平比較(±s)

表2 觀察組不同嚴重程度患兒的TLR4、CXCR3及Mig水平比較(±s)

組別輕中度組重度組t值P值例數(shù)65 45 TLR4(ng/mL)23.02±5.58 26.49±6.01-3.107 0.002 CXCR3(ng/mL)14.41±3.10 17.07±5.03-3.429 0.001 Mig(pg/mL)98.89±29.83 121.84±32.20-3.840 0.001

2.3 單核細胞TLR4、淋巴細胞CXCR3及血清Mig的相關(guān)性 將TLR4、CXCR3及Mig進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：TLR4與Mig呈正相關(guān)(r=0.680，P＜0.05)，CXCR3與Mig呈正相關(guān)(r=0.395，P＜0.05)，TLR4與CXCR3呈正相關(guān)(r=0.396，P＜0.05)，見圖1。

圖1 相關(guān)分析圖

3 討論

毛細支氣管炎發(fā)生的主要機制是免疫功能異常，與免疫功能相關(guān)的細胞有很多種，其中比較典型的是T淋巴細胞亞群紊亂，即表現(xiàn)為CD4/CD8比值升高[12]。有研究稱，趨化因子及其受體可以激活炎癥細胞，炎癥細胞可遷移至氣道中，引發(fā)氣道炎癥[13]。CXCR3與其配體作用后會參與T細胞的激活和遷移，CXCR3本身的表達情況也會受到影響。氣道炎癥及上皮細胞的損傷參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展，目前認為，在哮喘的發(fā)病機制中，有CXCR3及其配體的參與。研究發(fā)現(xiàn)CXCR3具有減少氣道炎癥和改善氣道反應(yīng)性的作用，目前關(guān)于CXCR3及其受體在毛細支氣管炎患兒中表達特征的研究較少。

本實驗采用流式細胞術(shù)檢測CXCR3及Mig的表達特點，結(jié)果顯示：觀察組CXCR3和Mig表達明顯高于對照組；觀察組重度患兒CXCR3和Mig表達明顯高于輕中度患兒。提示CXCR3與其配體結(jié)合后可加快炎癥細胞向氣道募集和遷移的速度，炎癥區(qū)域處又會募集到大量炎癥細胞，加重組織損傷，炎癥因素被認為是毛細支氣管炎的主要發(fā)病因素[14]。炎癥反應(yīng)發(fā)生時，Th1細胞大量分泌IFN-γ，其進一步刺激巨噬細胞分泌Mig，Mig濃度顯著增加，Mig水平還可反映Th1細胞的免疫狀態(tài)，可對疾病的嚴重程度進行評估。以往的研究表明，RSV感染大鼠肺泡灌洗液中Mig的水平顯著升高，Mig水平升高促進了RSV感染引起的炎癥反應(yīng)[15]。

在哮喘發(fā)病過程中有嗜酸性粒細胞的參與，而毛細支氣管炎與支氣管哮喘發(fā)病機制具有一定的同源性。有研究表明，Mig參與了嗜酸細胞活化導致嗜酸性粒細胞向肺內(nèi)的趨化和聚集過程[15-16]。結(jié)合本研究結(jié)果，毛細支氣管炎患兒的血清Mig的水平均高于對照組，Mig可能參與了上述過程，促進了毛細支氣管炎的發(fā)生與發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示：觀察組TLR4水平明顯高于對照組；觀察組重度患兒TLR4水平明顯高于輕中度患兒。Toll樣受體在固有免疫和獲得性免疫中均扮演了重要角色，可利用其來識別相應(yīng)的病原體。在一些病毒感染性疾病中均有T LR4的參與，其主要影響機體的免疫反應(yīng)。研究稱在氣道炎癥疾病中，TLR4水平的升高可加重炎癥反應(yīng)，加重組織損傷[17]。還可使T細胞大量募集到機體受到免疫攻擊的區(qū)域，使此區(qū)域變成來了機體T細胞抵抗感染、免疫反應(yīng)的場所，氣道上皮細胞受損程度加大。TLR4水平與氣道受損程度呈正相關(guān)，也與疾病程度呈正相關(guān)關(guān)系。

本研究經(jīng)Pearson法分析結(jié)果顯示，TLR4水平與Mig、CXCR3水平呈正相關(guān)，CXCR3水平與Mig水平呈正相關(guān)。Mig具有趨化性，其能與CXCR3特異性結(jié)合，使機體發(fā)生Ras和ERK級聯(lián)反應(yīng)。在此狀態(tài)下，大量炎癥細胞諸如趨化粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞都被大量募集到炎癥部位。再加上在此區(qū)域上還有CD8+T細胞和CD4+T細胞等免疫細胞發(fā)揮抗感染作用，使此區(qū)域的炎癥反應(yīng)更加嚴重，因此，組織損傷也更加嚴重。體現(xiàn)在氣道炎癥疾病中，可能會導致哮喘及其他一些炎癥疾病。而毛細支氣管炎氣道高反應(yīng)性主要與炎癥反應(yīng)、T細胞浸潤和嗜酸性粒細胞聚集激活有關(guān)。結(jié)合TLR4的變化特點，考慮是毛細支氣管炎患兒T細胞亞群水平紊亂，抑制了機體的免疫功能，導致呼吸道反復感染，伴隨著Mig及CXCR3表達水平的升高，每種因子異常上升都會通過炎癥級聯(lián)反應(yīng)促進其他因子的異常表達，共同促進疾病進展。

Mig和CXCR3不僅有促進T細胞向周圍炎癥部位的遷移的作用，還能使淋巴器官中不同活化淋巴細胞之間的作用不斷增強。Mig和CXCR3結(jié)合后產(chǎn)生一系列反應(yīng)，能夠?qū)C體對病原體的反應(yīng)性發(fā)生變化。Mig具有特定的趨化作用，還能增強炎癥因子釋放及T細胞增殖過程。此外，過敏因素也可能參與了CXCR3致毛細支氣管炎的過程中，因為毛細支氣管炎中有嗜酸性粒細胞參與的機制已被臨床證實[18]。而嗜酸性粒細胞與過敏反應(yīng)存在密切關(guān)聯(lián)，所以猜測CXCR3是促進了嗜酸性粒細胞的趨化性來引起了過敏性炎癥。此外，CXCR3也可能誘導肥大細胞脫顆粒，促進肥大細胞在過敏性炎癥中向平滑肌的趨化性。結(jié)合本研究結(jié)果，推測CXCR3不僅參與毛細支氣管炎的炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性的形成，而且過敏因子的存在會影響其在毛細支氣管炎中的表達，這可能導致TLR4的增加。TLR4作用于淋巴細胞上，又會使CXCR3和Mig的表達量增加，三者呈正相關(guān)，共同參與毛細支氣管炎的發(fā)生發(fā)展。

已有研究發(fā)現(xiàn)了CXCR3和Mig水平在哮喘和變應(yīng)性鼻炎中的變化特點[19-20]，但CXCR3和Mig在毛細支氣管炎中是如何影響病程的原因尚未有臨床研究報道。本研究采用對照試驗探索單核細胞TLR4、淋巴細胞CXCR3和血清Mig在毛細支氣管炎中的表達特點及其相互關(guān)系具有一定的臨床參考價值。然而，本研究對炎癥機制的研究并不全面，還需要進一步的試驗。

綜上所述，毛細支氣管炎患兒單核細胞TLR4、淋巴細胞CXCR3及血清Mig表達明顯升高，且均與患兒病情程度有關(guān)，三者間表達呈正相關(guān)關(guān)系。