直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與錯配修復(fù)蛋白表達(dá)的相關(guān)性研究

許梅海，覃永平*，尹家瑜，韋潔勤，潘洋洋，申煒，蔣洪棉，劉剛

廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院

(南寧市第一人民醫(yī)院)放射科1、病理科2、胃腸外科3，廣西 南寧 530022

直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，若未經(jīng)有效控制治療可能會出現(xiàn)肝、肺轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重者威脅患者生命[1]。而直腸癌治療目的就是減少局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生，延長患者生存時間，及時明確疾病進(jìn)展并制定出針對性治療方案是其臨床治療的關(guān)鍵，因此術(shù)前對該類直腸癌患者進(jìn)行較為準(zhǔn)確的術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后生存評估，可指導(dǎo)臨床為其制定更具優(yōu)勢的治療方案。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DNA錯配修復(fù)蛋白(mismatch repair，MMR)的突變或甲基化，導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要機(jī)制之一，存在缺陷的MMR蛋白可影響正常細(xì)胞DNA復(fù)制，使其錯配修復(fù)功能喪失，導(dǎo)致細(xì)胞自身突變速度加快及腫瘤形成[2]。錯配修復(fù)(MMR)功能缺陷對結(jié)直腸癌患者的預(yù)后判斷、藥物療效預(yù)測有明確的指導(dǎo)意義[3]。在10%～20%的結(jié)直腸癌患者中可檢測到錯配修復(fù)缺陷(dMMR)，dMMR引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)，是一種特殊的DNA損傷模式。在一些中晚期直腸癌患者中，dMMR表達(dá)與化療反應(yīng)不敏感有關(guān)，且患者的局部區(qū)域轉(zhuǎn)移的發(fā)生率降低，局部區(qū)域轉(zhuǎn)移的發(fā)生率降低，因此早期直腸癌患者能通過局部切除治愈的機(jī)會減少，而直腸癌Ⅱ期對輔助化療的需求減少?；诖耍狙芯恳悦庖呓M織化學(xué)檢測法檢測直腸癌患者中常見的4種錯配修復(fù)蛋白(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)的表達(dá)情況，并分析其與直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2014年1月至2020年9月在廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院接受直腸癌根治術(shù)的120例原發(fā)性直腸癌患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤長徑、腫瘤位置(距離肛門外緣長度)、術(shù)前及隨訪截至?xí)r腺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物[包括癌胚抗原(CEA)、腫瘤相關(guān)糖類抗原(CA199、CA125、CA153)]、脈管癌栓、淋巴結(jié)侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等。對所有患者在手術(shù)后進(jìn)行隨訪復(fù)查觀察腫瘤和轉(zhuǎn)移情況，對于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的判定需要結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、結(jié)腸鏡、組織學(xué)或病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床病理檢查確診為直腸癌；(2)原發(fā)灶均行全直腸系膜根治術(shù)，切緣陰性患者；(3)術(shù)后均行規(guī)律性輔助治療；(4)臨床病理及隨訪資料完整等。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前院內(nèi)接受過放化療者；(2)合并其他惡性腫瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；(3)臨床資料不完整者等。本研究獲得廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。最后因18例患者失訪，6例患者術(shù)后影像資料不全，以及2例患者因直腸癌術(shù)后其他并發(fā)癥(如腸梗阻、感染等)死亡，最終納入研究者94例。

1.2 方法 在病例系統(tǒng)中收集所有患者術(shù)前相關(guān)的臨床資料包括有無吸煙史、酗酒史、高血壓史、糖尿病史、腫瘤家族史，并在術(shù)前及隨訪過程中均檢測腺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，包括CEA、CA199、CA125、CA153，使用全自動化學(xué)發(fā)光分析設(shè)備以及相應(yīng)配套的設(shè)備試劑來完成檢測，在檢測過程中CEA的檢測范圍正常界限數(shù)值在0～5 ng/mL，CA199正常界限數(shù)值在0～35 U/mL，糖類抗原CA125正常界限數(shù)值在0～37 U/mL，糖類抗原CA153正常界限數(shù)值在0～31 U/mL。所檢測的結(jié)果如果超出如上正常界限數(shù)值范圍，就判定為陽性檢測結(jié)果。所有手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本均采用免疫組化法來檢測MMR蛋白(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)的表達(dá)情況。以4種MMR蛋白中出現(xiàn)1～3種表達(dá)缺失現(xiàn)象為錯配修復(fù)基因缺失(dMMR)，將其作為dMMR組；以4種MMR蛋白均為陽性為錯配修復(fù)基因健全(pMMR)，將其作為pMMR組。

1.3 術(shù)后隨訪 以首次根治手術(shù)治療作為觀察起點，術(shù)后定期隨訪12個月，隨訪時腸鏡及病理提示局部復(fù)發(fā)或影像學(xué)檢查提示腹腔或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者隨訪終止，隨訪截止時間為2021年1月。隨訪時間為3～76個月，平均隨訪時間為(19.7±17.2)個月，隨訪方式采取門診或住院復(fù)查和電話相結(jié)合。對于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的判定需要臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、組織學(xué)或病理學(xué)檢查的支持，并將在隨訪過程中出現(xiàn)復(fù)發(fā)或腹腔、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者作為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，在隨訪結(jié)束無復(fù)發(fā)或腹腔、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者作為復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。采用ShapiroWilk檢驗分析計量資料的正態(tài)性，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；MMR蛋白表達(dá)和直腸癌復(fù)發(fā)和或轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性采用雙向無序分類資料的關(guān)聯(lián)性檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組直腸癌患者的臨床資料比較 94例直腸癌根治術(shù)標(biāo)本中，pMMR組有55例(58.5%)，dMMR組有39例(41.5%)。兩組患者術(shù)前臨床基線資料及術(shù)前腫瘤標(biāo)志物比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組直腸癌患者的臨床資料比較[±s，例(%)]

表1 兩組直腸癌患者的臨床資料比較[±s，例(%)]

項目年齡(歲)性別男女CEA正常升高CA199正常升高CA125正常升高CA153正常升高酗酒史有無吸煙史有無高血壓史有無糖尿病史有無腫瘤家族史有無pMMR組(n=55)65.2±10.9 37(67.3)18(32.7)52(94.5)3(5.5)49(89.1)6(10.9)50(90.9)5(9.1)54(98.2)1(1.8)9(16.4)46(83.6)10(18.2)45(81.8)17(30.9)38(69.1)6(10.9)49(89.1)5(9.1)50(90.9)dMMR組(n=39)66.9±10.9 25(64.1)14(35.9)33(84.6)6(15.4)32(82.1)7(17.9)38(97.4)1(2.6)38(97.4)1(2.6)5(12.8)34(87.2)9(23.1)30(76.9)9(23.1)30(76.9)5(12.8)34(87.2)4(10.3)35(89.7)t/χ2值0.744 0.102 1.580 0.950 0.720 0.061 0.230 0.340 0.700 0.008 0.000 P值0.459 0.097 0.210 0.330 0.400 1.000 0.635 0.560 0.403 0.776 1.000

2.2 MMR蛋白表達(dá)與直腸癌病理特征關(guān)系 在截至隨訪時間內(nèi)，在94例患者中，11例出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)并5例同時出現(xiàn)肝、肺轉(zhuǎn)移，17例出現(xiàn)肝、肺、腎上腺及腹膜腔轉(zhuǎn)移等，其中10例有肝、肺、腎上腺、卵巢結(jié)節(jié)或腫塊手術(shù)病理證實為直腸癌轉(zhuǎn)移，7例主要以影像學(xué)術(shù)前及術(shù)后隨訪對比提示肺、肝、脊柱、腹膜等轉(zhuǎn)移；66例無局部復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況。dMMR組患者的腹腔及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的比例明顯高于pMMR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)關(guān)聯(lián)性檢驗，MMR蛋白表達(dá)與直腸癌復(fù)發(fā)和或轉(zhuǎn)移雖然存在關(guān)聯(lián)性，但數(shù)值較小(列聯(lián)系數(shù)為0.198)，認(rèn)為兩者的關(guān)聯(lián)性較低；而dMMR組與pMMR組在腫瘤最大徑、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓、VEGF上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，在T分期上dMMR組與pMMR組均以T4期占比例居多，見表2。

表2 MMR蛋白表達(dá)與直腸癌病理特征的關(guān)系[例(%)]

3 討論

眾所周知，直腸癌治療的目的就是減少局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，隨著外科技術(shù)水平的提高，直腸癌患者長期生存或治愈已成為可能。而直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，其中肝臟是其血行轉(zhuǎn)移的主要靶器官[4]。但因直腸癌異質(zhì)性大，不同患者表現(xiàn)出多樣的腫瘤生物學(xué)特性及臨床病理特征，部分患者預(yù)后生存改善不明顯，術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。部分研究報道顯示，結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年生存率為40%～50%，約30%以上患者因疾病進(jìn)展危及生命，且處于相同分期的患者其預(yù)后也存在較大差異[5]。因此術(shù)前、術(shù)后進(jìn)行較為準(zhǔn)確的預(yù)后預(yù)測可對直腸癌選擇不同治療方式的可行性進(jìn)行評估，進(jìn)而幫助臨床制定更為合理有效的治療策略。

近年來，臨床上逐漸認(rèn)識到MMR在直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，MSI作為主要的遺傳不穩(wěn)定性之一，由dMMR所致，MMR系統(tǒng)主要由4個基因及其編碼的蛋白質(zhì)MLH1、MSH2、MSH6、PMS2組成，在DNA損傷反應(yīng)信號網(wǎng)絡(luò)中識別并修復(fù)堿基錯配、插入、缺失，維持細(xì)胞中DNA結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。對于Ⅱ期的直腸癌患者，MSI狀態(tài)直接決定其術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險及輔助治療的選擇。而對于Ⅳ期直腸癌患者，MSI狀態(tài)有助于篩查免疫抑制劑治療的適用人群。故而，臨床上逐漸將檢測錯配修復(fù)蛋白缺失情況作為判定腫瘤狀態(tài)的一項有效參考指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，在94例直腸癌患者的腫瘤組織中，dMMR患者39例(41.5%)，高于目前國內(nèi)外部分研究者既往的研究報道顯示的15.0%～30.1%[7-8]。這可能是人種或地域差異造成了特有表達(dá)的趨勢，也可能是本研究的樣本量相對較少造成的選擇性偏倚。路敏等[9]就錯配修復(fù)基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系研究中顯示MMR蛋白表達(dá)缺失與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小、病理組織學(xué)分類及pTNM分期等臨床病理特征相關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)dMMR與pMMR組在年齡、腫瘤長徑、T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、VEGF等病理特征差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但本研究結(jié)果表明dMMR組發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的比例高于pMMR組，這也提示MMR的缺失可能會加重腫瘤的惡化，或者認(rèn)為低分化環(huán)境更易加速基因的突變，同時MMR突變現(xiàn)象與其浸潤深度和轉(zhuǎn)移相關(guān)，這也提示pMMR與dMMR的發(fā)生發(fā)展機(jī)制不同，對應(yīng)的治療策略可能不同。這給臨床醫(yī)生在治療方式的選擇上提供了幫助，有研究提示MMR的缺失對氟尿嘧啶藥物不敏感[10]，幫助臨床在治療中采取個體化的治療方式。這說明錯配修復(fù)蛋白表達(dá)情況對預(yù)測直腸癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有提示作用并對臨床治療選擇有幫助。

本研究的局限性在于：(1)樣本量相對較小，后續(xù)研究中需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗證；(2)所有的數(shù)據(jù)目前均來自同一家醫(yī)院，不具有普遍性，以后需要多中心研究證實研究結(jié)果；(3)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的危險因素還有許多，如手術(shù)方式等，今后研究需要納入更多影響因素。