大鼠交泰丸含藥血清預(yù)處理對人腦膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的改善作用及其分子機制

區(qū)浩松，楊陽，趙俊云

北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

交泰丸是臨床上常用的治療心腎不交型失眠癥的中醫(yī)經(jīng)典方劑，以黃連、肉桂組方，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤的作用［1-2］。失眠是由于長期情緒緊張或抑郁、負(fù)性精神刺激及精神創(chuàng)傷等因素造成大腦皮層興奮與抑制調(diào)節(jié)功能失調(diào)而引起的，長期失眠可導(dǎo)致能量消耗增加，而能量產(chǎn)生的過程中伴有活性氧（ROS）的形成，大腦內(nèi)ROS 為主的自由基分子的增加和積累可引起氧化應(yīng)激損傷［3］。以往對于交泰丸作用機制的研究大多集中在其對失眠的治療作用方面，但關(guān)于其是否可以改善腦部細(xì)胞氧化損傷的研究較少?；诖?，2021年11月—2022年2月，本研究使用大鼠交泰丸含藥血清對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的人腦膠質(zhì)細(xì)胞（HEB）氧化損傷模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其對HEB 氧化損傷的改善作用，并從細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及衰老相關(guān)基因沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、趨化因子聯(lián)接因子1（CXCL1）、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O 亞族1（FOXO1）、P16、白細(xì)胞介素1α（IL-1α）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）、IL-6 的表達(dá)探討交泰丸抗腦部氧化損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 動物：SPF級雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2015-0015。細(xì)胞：HEB 購買自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。試劑：肉桂及黃連飲片購自北京同仁堂，β-半乳糖苷酶染色試劑盒、活性氧檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8 試劑盒購自北京翱翔生物科技有限公司，2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix購自武漢賽維爾生物科技有限公司Hoechst33342熒光染料、BCA 蛋白定量試劑盒、超敏發(fā)光液購自北京索萊寶科技有限公司，總RNA 小提試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司，RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo Fisher Scientific。儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本Sanyo，超微量分光光度計購自美國Pultton，QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System 購自美國 Thermo Fisher Scientific，共聚焦顯微鏡購自日本Olympus，流式細(xì)胞儀購自美國Beckman，正倒置一體顯微鏡購自美國Echo，酶標(biāo)儀購自德國BioTek。

1.2 交泰丸含藥血清制備 將SD 大鼠在正常環(huán)境、光照及飲食下進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，1 周后開始實驗。將大鼠隨機分為兩部分各5 只，分別制備含藥血清及空白血清。含藥血清：大鼠給予肉桂和黃連（1∶9）水提物灌胃，生藥含量為0.31 g/mL，灌服量為 1 次/天，每次 2 mL，連續(xù)灌服 5 d。第5 天時，大鼠禁食不禁水，在最后一次灌胃4 h 后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，從腹主動脈取血，3 000 r/min 離心10 min 提取血清，過濾除菌，56 ℃補液滅活30 min，分裝后在-20 ℃保存?？瞻籽澹捍笫蠼o予同體積蒸餾水灌胃，其他操作方法同上。將DMEM培養(yǎng)基與血清配制成10%完全培養(yǎng)基，待用。

1.3 細(xì)胞分組處理及氧化損傷模型的建立 將HEB 以 4×104/孔接種到 96 孔板，培養(yǎng) 12 h 后分為對照組、模型組及交泰丸組，每組設(shè)6個復(fù)孔。對照組及模型組加入空白血清培養(yǎng)基，交泰丸組加入含藥血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，交泰丸組及模型組使用終濃度為10 μmol/L的H2O2處理建立HEB氧化損傷模型，對照組使用等體積PBS 處理。處理1 h 后，各組更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞氧化損傷比例觀察 三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)液，用PBS 洗1 次，用染色固定液在室溫下固定 15 h。PBS 洗滌 3 次，將 500 μL β-半乳糖苷酶染色工作液加入孔內(nèi)，37 ℃孵育過夜。顯微鏡下每孔隨機取三個細(xì)胞密度大致相同的視野，按照（視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)）×100%計算陽性細(xì)胞比例，陽性細(xì)胞比例即為氧化損傷比例。

1.5 細(xì)胞活力觀察 采用CCK-8 法。三組細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后吸出培養(yǎng)液，取 100 μL CCK-8 工作液加入各孔內(nèi)，2 h 后用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm 時的光密度值（OD），以（交泰丸組OD－模型組OD/對照組OD-模型組OD）×100%計算細(xì)胞活力。

1.6 細(xì)胞凋亡情況觀察 將三組細(xì)胞消化、離心后棄去上清液，加入終濃度為5 μg/mL的Hoechst33342熒光染料和終濃度10 μg/mL的PI染色液，在37 ℃孵育20 min。離心后棄去上清液，PBS 重懸，避光。上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，設(shè)第一通道的激發(fā)波長為405 nm、檢測波長為450 nm，設(shè)第二通道的激發(fā)波長為488 nm、檢測波長為610 nm。

1.7 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平觀察 采用活性氧熒光染色法。三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后吸出培養(yǎng)液，加入終濃度為5 μg/mL 的Hoechst33342 熒光染料和終濃度1 μmol/L的DCFH-DA熒光染料，在37 ℃孵育20 min，使用DMEM 培養(yǎng)基輕輕洗3 次后加入PBS。在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，設(shè)第一組通道激發(fā)波長為405 nm、檢測波長為430～470 nm，設(shè)第二組通道激發(fā)波長為488 nm、檢測波長為500～600 nm。

1.8 細(xì) 胞 SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA 表達(dá)檢測 采用 qRT-PCR 法。三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后吸出培養(yǎng)液，嚴(yán)格按照總RNA小提試劑盒操作方法提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃60 min，70 ℃5 min。使用實時熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴增，SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6及內(nèi)參GAPDH 的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。PCR 擴增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)，運行機器自身的熔解曲線。采用2－ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

表1 SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6及GAPDH引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov檢驗和Shapiro-Wilk檢驗進(jìn)行正態(tài)性檢驗，若呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；若呈非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞氧化損傷比例比較 β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示，對照組、模型組、交泰丸組細(xì)胞氧化損 傷 比例 分 別 為 12.78% ± 2.24%、32.60% ±8.55%、17.08% ± 2.84%，模型組＞交泰丸組＞對照組（P均＜0.05）。見OSID碼圖1。

2.2 三組細(xì)胞活力比較 對照組、模型組、交泰丸組細(xì)胞活力分別為 99.44% ± 4.84%、49.75% ±1.62%、54.36% ± 2.47%，對照組＞交泰丸組＞模型組（P均＜0.05）。

2.3 三組細(xì)胞凋亡情況比較 對照組、模型組、交泰丸組細(xì)胞凋亡率分別5.64% ± 4.44%、59.37% ±1.70%、41.6%±1.08%，模型組＞交泰丸組＞對照組（P均＜0.05）。見OSID碼圖2。

2.4 三組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平比較 激光共聚焦顯微鏡下可見，對照組細(xì)胞生長良好，輪廓完整，核膜邊界清晰，ROS熒光強度低；模型組細(xì)胞形態(tài)有明顯變化，細(xì)胞膜邊緣輪廓不清晰，核膜發(fā)生部分裂解，ROS熒光強度增強；交泰丸組細(xì)胞膜及核膜結(jié)構(gòu)較模型組更加完整，ROS熒光強度降低。見OSID碼圖3。

2.5 三組細(xì)胞SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA表達(dá)比較 見表2。

表2 三組細(xì)胞SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA表達(dá)比較（）

表2 三組細(xì)胞SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA表達(dá)比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組交泰丸組IL-6 mRNA 1.01±0.14 1.01±0.22 1.08±0.47 SIRT1 mRNA 1.00±0.04 0.43±0.04*0.96±0.05#CXCL1 mRNA 1.00±0.00 1.75±0.00*0.86±0.18 FOXO1 mRNA 0.98±0.08 0.74±0.03*1.00±0.04#P16 mRNA 1.03±0.31 1.02±0.26 1.04±0.35 IL-1α mRNA 1.05±0.33 1.01±0.18 1.02±0.26 IGFBP3 mRNA 1.00±0.02 1.05±0.40 1.03±0.30

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，心腎不交型失眠主要以心腎不交為主軸，心火不降，腎水不升，形成未濟現(xiàn)象，陰陽失交而發(fā)為失眠［4］。交泰丸以黃連、肉桂組方，黃連性寒、味苦，有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，具有抗炎、抗氧化、保護神經(jīng)的作用［5］；肉桂性大熱、味辛甘，有補火助陽、散寒止痛、溫經(jīng)通脈之功效，具有神經(jīng)保護、降脂、抗氧化、抗炎的作用［6］。兩藥配伍體現(xiàn)了中醫(yī)交通心腎、引火歸元的治則。

本研究使用終濃度為10 μmol/L 的H2O2處理HEB 細(xì)胞建立了細(xì)胞氧化損傷模型，并使用交泰丸含藥血清培養(yǎng)基預(yù)處理，結(jié)果顯示交泰丸含藥血清降低了細(xì)胞氧化損傷比例，提示交泰丸含藥血清處理能有效抵抗H2O2誘導(dǎo)的HEB 細(xì)胞氧化損傷。本研究結(jié)果同時顯示，交泰丸含藥血清預(yù)處理的HEB細(xì)胞活力增強、ROS熒光強度減弱、凋亡細(xì)胞比例降低，提示交泰丸含藥血清可促進(jìn)H2O2處理的細(xì)胞活力恢復(fù)、降低細(xì)胞內(nèi)氧化損傷水平，并可能通過抗凋亡途徑抵抗細(xì)胞氧化損傷。

氧化損傷和炎癥是導(dǎo)致衰老的重要因素，SIRT1、FOXO1 可共同調(diào)節(jié)氧化損傷和炎癥，從而參與衰老的調(diào)控［7］。FOXO1是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族的O亞類成員之一，也被稱為長壽因子，廣泛存在于生物體中，在轉(zhuǎn)錄中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。核激活的FOXO1可通過控制下游基因的表達(dá)，與靶點結(jié)合參與抗氧化應(yīng)激、細(xì)胞存活、凋亡、自噬、代謝調(diào)節(jié)等生物過程［8］。SIRT1是NAD+依賴性脫乙酰酶家族的成員，是重要的長壽基因。SIRT1參與DNA修復(fù)、凋亡、炎癥、衰老等生物過程，F(xiàn)OXO1 可受SIRT1 調(diào)控激活細(xì)胞自噬，參與細(xì)胞增殖等過程，對衰老、氧化應(yīng)激等有著重要作用［9］。本研究結(jié)果顯示，交泰丸組SIRT1、FOXO1 mRNA 表達(dá)水平顯著上升，提示交泰丸可能通過調(diào)控細(xì)胞自噬、增殖等途徑發(fā)揮抗細(xì)胞氧化損傷與抗衰老的作用。本研究選取的CXCL1、IL-1α、IL-6、P16、IGFBP3 均是衰老相關(guān)基因。CXCL1 是CXC 趨化因子重要的家族成員，參與許多炎癥性疾病發(fā)展，也是一種有效的中性粒細(xì)胞趨化因子和激活劑，主要通過CXCR2 受體起作用［10］。IL-1α 與 IL-6 均是促炎因子，IL-6 受 IL-1α 調(diào)控，參與細(xì)胞衰老，與衰老誘導(dǎo)的炎癥密切相關(guān)［11-12］。本研究結(jié)果顯示，模型組 CXCL1 mRNA 表達(dá)較對照組上升，交泰丸組CXCL1 mRNA 表達(dá)較模型組下調(diào)，提示交泰丸可能通過抗炎癥途徑減少炎性細(xì)胞衰老的發(fā)生。本研究同時發(fā)現(xiàn)，IL-1α、IL-6、IGFBP3、P16的mRNA 表達(dá)無差異，后續(xù)我們將設(shè)計不同時間和劑量等梯度深入探討可能的分子水平變化。

綜上所述，本研究基于交泰丸交通心腎、引火歸元的理論，通過大鼠交泰丸含藥血清干預(yù)HEB 氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)交泰丸含藥血清可抑制H2O2誘導(dǎo)的HEB氧化損傷，其可能通過增強細(xì)胞活力、抗細(xì)胞凋亡、降低胞內(nèi)ROS 水平以及抗炎發(fā)揮作用。本研究只是初步探討了交泰丸對腦部氧化損傷的改善作用及其機制，后續(xù)還將結(jié)合體內(nèi)研究進(jìn)一步深入探究交泰丸抗腦部氧化損傷分子機制，為中醫(yī)心腎理論的生物學(xué)闡釋提供實驗依據(jù)。