外泌體源性miRNA在不同寄生蟲病中調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制研究進(jìn)展

冶賡博 ，崔紫煙 ，吳俊杰 ，乜茹 ，于文昊 ，王志鑫 ，樊海寧 ，任利

1 青海大學(xué)研究生院，西寧 810000；2 青海省包蟲病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科

寄生蟲病廣泛傳播于全球，至今依然是影響全球公共衛(wèi)生的重要疾病。在寄生蟲和其依賴的宿主相互演化適應(yīng)期間，如果寄生蟲想要長(zhǎng)時(shí)間存活下來(lái)并且保留感染能力，蟲體必須發(fā)展建立自己的一套分子調(diào)控機(jī)制，從而抵御宿主免疫系統(tǒng)的一系列攻擊。外泌體是由多種細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡外小體，其可攜帶多種微小RNA（miRNA）從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后干擾基因表達(dá)，在多種生物過(guò)程中發(fā)揮著重要的信息傳遞作用［1］。巨噬細(xì)胞是脊椎動(dòng)物體內(nèi)最重要的免疫細(xì)胞之一，當(dāng)被外界環(huán)境中的各種因素誘導(dǎo)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生表型和功能的變化，稱為巨噬細(xì)胞極化［2］。巨噬細(xì)胞極化表型中，研究最多的是經(jīng)典途徑激活型（M1型）和可替代途徑激活型（M2型），二者比例的失衡與多種疾病病理過(guò)程和免疫應(yīng)答密切相關(guān)。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)在寄生蟲與宿主相互作用的過(guò)程中，外泌體可通過(guò)其攜帶的miRNA 調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，從而改變自身及周圍環(huán)境，引起宿主免疫逃逸或免疫抑制，維持寄生。本文就現(xiàn)階段外泌體源性miRNA 在寄生蟲病中對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控機(jī)制綜述，以期更深入的了解寄生蟲與宿主間的相互作用。

1 外泌體源性miRNA 在原蟲病中調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制

1.1 利什曼原蟲病 利什曼原蟲病是由利什曼原蟲寄生于人和動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)引起的一種寄生蟲病。巨噬細(xì)胞是利什曼原蟲增殖的最終宿主細(xì)胞，也是控制或加重利什曼原蟲病的關(guān)鍵，其在感染過(guò)程中發(fā)揮雙重作用，感染的成功與否取決于感染利什曼原蟲的物種與宿主免疫反應(yīng)的類型和程度之間的相互作用。研究顯示，在329種利什曼原蟲蛋白中，超過(guò)一半是由外泌體釋放的，其中大部分為利什曼原蟲病的主要毒力因子。ATAYDE 等［3］在利什曼原蟲病的研究中發(fā)現(xiàn)，其原蟲的外泌體通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞信號(hào)傳遞的調(diào)節(jié)激發(fā)致病感染的機(jī)制，并且能在感染的部位招募中性粒細(xì)胞進(jìn)而加重感染力。在蟲體相對(duì)分子質(zhì)量為63 kDa 的糖蛋白（GP63）進(jìn)入巨噬細(xì)胞并發(fā)揮毒力過(guò)程中，外泌體先與質(zhì)膜結(jié)合，再以GP63 作為媒介參與入膜反應(yīng)［4］。另有研究報(bào)道，在利什曼原蟲長(zhǎng)期感染過(guò)程中，miRNA let-7 家族的轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)生于外泌體內(nèi)，并憑借著Myd/核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號(hào)通路移動(dòng)到宿主巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，隨后釋放相應(yīng)的導(dǎo)致疾病的激化因子，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主巨噬細(xì)胞活性的抑制，協(xié)助蟲體逃避免疫反應(yīng)［5］。在感染過(guò)程中，巨噬細(xì)胞通常表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)性的類型變化，M1 型出現(xiàn)在早期，可招募炎性細(xì)胞以對(duì)抗寄生蟲，此為促炎效果；待寄生蟲消滅后，再轉(zhuǎn)化為M2 型抑制炎性細(xì)胞的募集，此為抗炎效果。在利什曼原蟲感染早期，巨噬細(xì)胞可被昆蟲等載體的唾液極化成M2 型，從而在感染早期增加蟲體傳染性及持久性。由于巨噬細(xì)胞M2 型極化，利什曼原蟲表現(xiàn)出的毒力因子可以破壞宿主的殺微生物機(jī)制，促進(jìn)蟲體增殖。然而，M1 巨噬細(xì)胞在感染后期發(fā)揮作用，引發(fā)免疫反應(yīng)加劇，導(dǎo)致病變惡化［6］。以上研究提示，巨噬細(xì)胞極化為寄生蟲免疫逃逸提供了有利條件，其中寄生蟲感染早期促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型極化發(fā)揮了重要作用。

1.2 弓形蟲病 弓形蟲是一種可以寄生于幾乎所有溫血?jiǎng)游?，并且呈現(xiàn)全球分布的原生動(dòng)物。弓形蟲病易被免疫力低下人群或胎兒感染，是孕期宮內(nèi)感染導(dǎo)致胚胎畸形的重要疾病之一。巨噬細(xì)胞是弓形蟲感染急性期的主要吞噬細(xì)胞，在吞噬弓形蟲后會(huì)釋放帶有弓形蟲抗原的外泌體，其內(nèi)含有許多miRNA；弓形蟲感染宿主細(xì)胞以后，外泌體可攜帶多種miRNA 調(diào)控細(xì)胞的分裂，從而影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期。POPE等［7］在被弓形蟲感染的宿主細(xì)胞和外泌體中發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞增殖和癌癥相關(guān)的miR-92a、miR-125b、miR-125a-5p、miR-503 和 miR-99a-star。此外，miR-23b在弓形蟲外泌體中高度富集，其可抑制白細(xì)胞介素17（IL-17）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等介導(dǎo)的NF-κB活化和炎癥因子表達(dá)，減輕巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，從而抑制自身免疫性炎癥。HAKIMI等［8］研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲外泌體能夠分泌一種分子開關(guān)，可以選擇性地以特定方式塑造宿主的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，主要的靶點(diǎn)包括NF-κB、Fos 家族轉(zhuǎn)錄因子c-Fos、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（STAT）3/6及原癌基因c-Myc。LI等［9］通過(guò)研究剛地弓形蟲外泌體對(duì)體外巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)了弓形蟲外泌體可以通過(guò)JNK 信號(hào)通路刺激巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1方向極化，引起細(xì)胞免疫應(yīng)答。

1.3 瘧疾 瘧疾是經(jīng)按蚊叮咬或輸入帶瘧原蟲者的血液而感染瘧原蟲所引起的蟲媒傳染病，也是全世界最具毀滅性的傳染病之一。研究顯示，瘧原蟲感染的紅細(xì)胞外泌體可以有效活化巨噬細(xì)胞［10］。目前，外泌體源性miRNA 在瘧原蟲感染機(jī)制中的作用尚不清楚。但相關(guān)文獻(xiàn)提示，瘧疾的感染可明顯改變外泌體源性miRNA 的表達(dá)，且瘧疾的嚴(yán)重程度和外泌體的釋放量有關(guān)［11］。在伯氏瘧原蟲中，miR-146a 表達(dá)上調(diào)，miR-193b 的表達(dá)下調(diào)［12］，其與 M2 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)［13］。與未感染的人類個(gè)體比較，惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲患感染者外泌體中的miRNA hsa-let-7a-5p 上調(diào)，而單獨(dú)間日瘧原蟲感染者 的 miRNA hsa-miR-150-5p 及 hsa-miR-15b-5p 上調(diào)，其與M1 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)［14］。此外，與正常小鼠比較，miRNA 在腦瘧疾模型小鼠中的表達(dá)有顯著差別［15］。為了確認(rèn)這些外泌體衍生的miRNA 功能，還需進(jìn)一步使用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团R床樣本進(jìn)行研究。

2 外泌體源性miRNA 在蠕蟲病中調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制

2.1 血吸蟲病 血吸蟲病是由裂體吸蟲屬血吸蟲引起的一種慢性寄生蟲病，影響著78個(gè)熱帶和亞熱帶國(guó)家的2 億多人［16］。慢性血吸蟲病的臨床表現(xiàn)是宿主對(duì)血吸蟲卵產(chǎn)生免疫應(yīng)答的結(jié)果，免疫反應(yīng)隨著寄生蟲感染的遷移和成熟，以時(shí)間依賴的方式急劇演變，急性期與輔助性T 細(xì)胞1（Th1）的促炎反應(yīng)有關(guān)，隨后Th1 反應(yīng)很快被Th2 的抗炎反應(yīng)所取代。Th2 反應(yīng)主要是對(duì)沉積在肝臟中的大量血吸蟲卵的反應(yīng)，可觸發(fā)肝臟組織損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞纖維化并產(chǎn)生膠原蛋白，久而久之導(dǎo)致肝纖維化［17］。在纖維化疾病中，細(xì)胞因子的釋放、溶酶體功能的障礙等都會(huì)改變外泌體的分泌進(jìn)而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型變化［18］。血吸蟲病作為一種與炎癥和纖維化密切相關(guān)的疾病，與外泌體有著密切的關(guān)系。有學(xué)者從日本血吸蟲中分離并提取了外泌體樣囊泡，發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生TNF-α、CD16、CD32 等促炎因子，同時(shí)和巨噬細(xì)胞極化有關(guān)［19］。ZHU 等［20］在蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上對(duì)血吸蟲外泌體內(nèi)403 個(gè)蛋白質(zhì)組成成分進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，這些蛋白質(zhì)成分不僅能夠催化細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程及抗體結(jié)合的活性，還能夠?qū)iRNA 傳導(dǎo)到宿主細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而發(fā)揮更強(qiáng)的寄生作用。GIRI等［21］研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a 可通過(guò) PI3K/AKT 通路靶向蛋白酪氨酸磷酸酶基因（PTEN），導(dǎo)致TNF-α、IL-12、精氨酸酶1（Arg-1）和IL-10 的上調(diào)，從而調(diào)控巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。LIU 等［22］利用RAW264.7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲外泌體含有寄生蟲特異性miR-125b，其具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 型極化的作用。除此之外，HE 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠被日本血吸蟲感染后，宿主血清內(nèi)的miR-223、miR-146b 表達(dá)量表現(xiàn)出明顯的增加；而miR-146b 的上調(diào)與巨噬細(xì)胞M2型極化相關(guān)［24］。以上研究提示，外泌體miRNA 可以作為血吸蟲病與宿主細(xì)胞之間的一種通信機(jī)制，參與巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控并調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答。

2.2 絳蟲病 棘球絳蟲的幼蟲感染所致的寄生蟲病稱為包蟲?。ㄓ址Q棘球蚴?。?，呈現(xiàn)地方性，青海、新疆、西藏等牧區(qū)及少數(shù)民族地區(qū)為我國(guó)棘球絳蟲感染多發(fā)區(qū)。包蟲病可分為囊型包蟲病和泡型包蟲病二種，分別由細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲（棘球蚴）和多房棘球絳蟲的幼蟲（泡球蚴）寄生所致。與囊型包蟲病比較，泡型包蟲病對(duì)宿主的危害更為嚴(yán)重。在小鼠泡型包蟲病模型研究中，王東旭等［25］發(fā)現(xiàn)極化后的M1/M2 型巨噬細(xì)胞參與了泡球蚴感染過(guò)程。青海省包蟲病研究課題組基于大量研究進(jìn)一步提出假設(shè)，泡球蚴可以向外釋放攜帶大量miRNA 的外泌體，調(diào)控巨噬細(xì)胞內(nèi)相關(guān)靶基因表達(dá)，影響巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)，進(jìn)而協(xié)助免疫逃逸過(guò)程。課題組培養(yǎng)泡球蚴原頭節(jié)并成功提取了其外泌體，并將這些外泌體及其攜帶的miRNA 與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)間、不同外泌體濃度的影響下，外泌體可通過(guò)其攜帶的miRNA 影響巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)，但具體方式及機(jī)制仍在進(jìn)一步研究中。

豆?fàn)钅椅豺什∈嵌範(fàn)顜Ы{蟲的中絳期豆?fàn)钅椅豺始纳碌慕{蟲病，嚴(yán)重感染時(shí)可引起宿主肝臟損害、消化紊亂甚至死亡。在豆?fàn)钅椅豺矢腥菊T導(dǎo)的免疫抑制過(guò)程中，WANG 等［26］發(fā)現(xiàn)，外泌體源性miRNA let-7-5p 的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了巨噬細(xì)胞向M2型的極化，其中參與M2 型巨噬細(xì)胞極化的結(jié)合蛋白主要為CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白。

2.3 線蟲病 線蟲病是線蟲成蟲或幼蟲寄生而引起的疾病，臨床表現(xiàn)因蟲種、數(shù)量、寄生部位及人體免疫狀態(tài)而異。目前，有關(guān)寄生線蟲外泌體源性miRNA 的研究較少。在胃腸線蟲病中，BUCK 等［27］觀察到分泌型外泌體內(nèi)含有能夠抑制白細(xì)胞介素33 受體及雙特異性磷酸酶1 表達(dá)的miRNA 及Y RNA，提示外泌體源性miRNA 與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中靶基因的表達(dá)有關(guān)；該研究還發(fā)現(xiàn)感染者的細(xì)胞外囊泡可同時(shí)抑制M1 及M2 型巨噬細(xì)胞極化。WAN等［28］研究顯示，N-連接糖基化在圓管線蟲病中促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞極化，其中PI3K-AKT 途徑的代謝重編程起著重要作用。

綜上所述，外泌體及其攜帶的miRNA 可在多種原蟲病、蠕蟲病等寄生蟲病中通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)。在寄生蟲感染過(guò)程中，從初始的劇烈免疫反應(yīng)到后期與宿主的相互適應(yīng)，巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的改變占據(jù)著重要地位。外泌體源性miRNA 在這一系列過(guò)程中參與到巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控，且在宿主與宿主細(xì)胞、寄生蟲與宿主細(xì)胞及寄生蟲之間形成很多的復(fù)雜串?dāng)_。目前，生物信息學(xué)及蛋白組學(xué)等方面的快速發(fā)展為進(jìn)一步了解外泌體源性miRNA 在寄生蟲病中的調(diào)控調(diào)控機(jī)制提供了可能，比如通過(guò)高通量測(cè)序來(lái)鑒定更多的miRNA，進(jìn)而分析生理及病理?xiàng)l件下的分子相互作用。這些將有望打開治療疾病的新局面，為新的寄生蟲病防治策略奠定基礎(chǔ)。