1例人血源性嗜低溫弓形菌的分離鑒定與文獻復(fù)習(xí)*

賈 靜，郭明發(fā)，徐 璐，楊俊文，楊俊梅

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院檢驗科，河南鄭州 450000

嗜低溫弓形菌屬于弓形菌屬，隸屬于細(xì)菌域、變形菌門、ε-變形菌綱、彎曲菌目、彎曲菌科，目前屬內(nèi)已鑒定出25個物種[1]。弓形菌在需氧和厭氧環(huán)境中均可生長，革蘭染色陰性，菌體呈彎曲或“S”形桿菌。弓形桿菌是一種重要的食源性人畜共患病原體，常見的菌種主要有嗜低溫弓形菌、布氏弓形菌、硝化弓形菌和斯氏弓形菌[2-3]。對該致病菌的快速鑒定與甄別可為患者診斷和有效治療做出迅速處理。因此，本研究對2018年在河南省兒童醫(yī)院就診的1例溺糞患者發(fā)生血源感染后分離的細(xì)菌進行鑒定，以期對該類細(xì)菌引起疾病的診治提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 患兒女，1歲3個月，因“溺糞、心肺復(fù)蘇術(shù)后75 min”急診入院。患兒75 min前玩耍時溺糞，3～4 min后家屬發(fā)現(xiàn)患兒面部朝上，伴青紫明顯，意識喪失；立即給予清理呼吸道、拍背、胸外按壓等治療后送至當(dāng)?shù)乜h人民醫(yī)院，給予“氣管插管”及“胸外按壓”等搶救治療，未見明顯好轉(zhuǎn)，遂由當(dāng)?shù)?20送入本院。急診科以“溺水、呼吸衰竭”收入院。入院查體：體溫35.5 ℃，脈搏50次/分，心音極低，心率50次/分，呼吸30次/分，血壓53/26 mm Hg。血氧飽和度(SPO2)79%，淺昏迷，全身皮膚無黃染、出血點及紫癜，雙側(cè)瞳孔等大等圓，直徑4 mm，對光反射遲鈍，復(fù)蘇囊加壓給氧下口唇發(fā)紺明顯，四肢肌張力低，膝腱反射消失，布魯金斯氏征陰性，雙側(cè)巴氏征陰性，雙側(cè)克氏征陰性，四肢末梢涼，毛細(xì)血管充盈時間(CRT)>5 s。頸軟，雙肺呼吸音低，可聞及密集細(xì)濕性啰音，未聞及明顯病理性雜音。腹膨隆明顯，腹軟，肝脾肋下未觸及，未觸及包塊，腸鳴音弱。入院實驗室檢查：白細(xì)胞計數(shù)16.59×109/L，中性粒細(xì)胞百分比3.4%，淋巴細(xì)胞百分比94.4%，C-反應(yīng)蛋白定量0.80 mg/L；肌酸激酶同工酶11.01 ng/mL，B型鈉尿肽前體140.5 pg/mL，肌鈣蛋白T 0.031 ng/mL；床旁血氣提示酸堿度6.918，血清葡萄糖26 mmol/L，乳酸10.0 mmol/L，鉀2.7 mmol/L為危急值；血氨138.7 μmol/L。支氣管鏡檢查發(fā)現(xiàn)氣管及各級支氣管壁均有大量淡黃色斑塊狀物質(zhì)附著，給予充分灌洗，附著物脫落，各級支氣管均灌洗出渾濁淡黃色液體。床旁胸片可見兩肺大片影，左肺透光度減低。入院第2天，復(fù)查胸片可見右上肺片狀影較前顯著，細(xì)菌毒素動態(tài)定量124.5 pg/mL，肌酸激酶同工酶61.830 ng/mL，B型鈉尿肽前體20 443.000 pg/mL，肌鈣蛋白T 0.063 ng/mL，明顯升高，考慮與溺糞引起感染和窒息相關(guān)。

1.2儀器與試劑 哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力色血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，全自動血培養(yǎng)儀及血培養(yǎng)瓶(美國BD公司)，MALDI Biotyper 微生物快速鑒定儀及靶板、基質(zhì)液和甲酸(德國布魯克公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌分離鑒定 該患者入院后24 h內(nèi)進行雙側(cè)血培養(yǎng)檢查。臨床上嚴(yán)格按照血培養(yǎng)操作流程進行血培養(yǎng)標(biāo)本采集，運用BD公司BACTEC Plus Aerobic/F血培養(yǎng)瓶機器進行檢測。血培養(yǎng)機器連續(xù)培養(yǎng)33 h 40 min后報陽。

1.3.2細(xì)菌的分離培養(yǎng)與革蘭染色鏡檢 將血培養(yǎng)瓶菌懸液離心后接種于哥倫比亞血瓊脂平板及巧克力血瓊脂平板，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，哥倫比亞血瓊脂平板和巧克力血瓊脂平板上均見細(xì)小突起，光滑濕潤，邊緣整齊的圓形菌落，挑取單個菌落革蘭染色鏡檢。

1.3.3基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)檢測 以乙腈∶純水∶三氟乙酸(TFA)為50∶47.5∶2.5比例配制標(biāo)準(zhǔn)溶劑；取Bruker HCCA粉末(每管2.5 mg)添加250 μL標(biāo)準(zhǔn)溶劑充分溶解備用。使用接種環(huán)取哥倫比亞血瓊脂平板上培養(yǎng)的單個菌落，加1 mL 70%乙醇振蕩滅活，離心去上清液，再向沉淀中加入70%甲酸50 μL及乙腈50 μL，振蕩離心取上清液待測。取 1 μL上清液滴于靶板上晾干，再加上1 μL基質(zhì)溶液，晾干后上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)菌培養(yǎng) 哥倫比亞血瓊脂平板上培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)細(xì)小突起，光滑濕潤，邊緣整齊的單個圓形菌落，見圖1。細(xì)菌革蘭染色陰性，見圖2，呈輕微彎曲，無芽孢特征，尿素酶試驗陰性，氧化酶、觸酶試驗陽性。

圖1 哥倫比亞血平板35 ℃培養(yǎng)24 h

圖2 革蘭染色鏡檢(油鏡，×1 000)

2.2細(xì)菌鑒定 MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果顯示該分離株與已知菌庫中嗜低溫弓形菌一致，分值為1.907，見圖3。

圖3 質(zhì)譜菌落鑒定圖譜

2.3治療經(jīng)過 患兒入院后，監(jiān)測生命體征，給予機械通氣，心肺復(fù)蘇及搶救藥物應(yīng)用，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、抗感染、止血等綜合治療。入院第3天患兒突然出現(xiàn)心率下降至60次/分，予心肺復(fù)蘇、搶救藥物應(yīng)用，后心跳為0次/分，血壓測不出，SPO2測不出，搶救后患兒自主心率無恢復(fù)，家屬要求自動出院。

3 討 論

與人類感染有關(guān)的弓形菌屬主要有嗜低溫弓形菌(群)和布氏弓形菌，這兩種菌主要引起急性腸胃炎，布氏弓形菌還可引起腸外感染，包括菌血癥、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、腹膜炎等[4]。嗜低溫弓形菌為微需氧細(xì)菌，適宜生長在中性或偏堿性環(huán)境中，主要存在于污水中，有潛在危害，人體接觸后可危害身體健康[5]。該患兒入院檢查顯示白細(xì)胞計數(shù)增高，細(xì)菌毒素動態(tài)定量檢測明顯升高，兩肺紋理粗，兩肺可見大片影及斑片影等炎癥體征，提示細(xì)菌感染，可引起菌血癥，入院及時進行血培養(yǎng)檢測。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定有一系列的流程和方法，耗時長，程序煩瑣，通常還需要檢測者具有一定的經(jīng)驗。MALDI-TOF-MS是近幾年發(fā)展起來的一種新型有機質(zhì)譜技術(shù)，是利用蛋白質(zhì)譜學(xué)的全新微生物快速檢測和鑒定技術(shù)，鑒定方法快速、準(zhǔn)確、可靠。目前國內(nèi)運用MALDI-TOF-MS鑒定和檢測微生物已經(jīng)取得了很好的進展，尤其是在細(xì)菌的種屬鑒定方面，已經(jīng)可以很好地將菌株鑒定到種的水平。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，嗜低溫弓形菌是一種潛在的食源性和水源性病原體，可通過食品處理過程的交叉污染、食用受污染的動物源食品、受污染的飲用水或直接被糞便污染而發(fā)生感染[6-7]。BRüCKNER等[8]研究顯示，嗜低溫弓形菌和布氏弓形菌是引起人類胃腸炎的新型病原體，并利用腸桿菌基因間重復(fù)一致序列-聚合酶鏈反應(yīng)(EICR-PCR)進行毒力基因測定，顯示嗜低溫弓形菌在體外有顯著的細(xì)胞毒作用。國外的調(diào)查顯示，嗜低溫弓形菌在雞肉中的流行率明顯高于豬肉和牛肉[9]。BARBOZA等[6]報道1例27歲的哥斯達黎加女性，因食用雞肉而罹患腹瀉，并從其血性水樣便中分離培養(yǎng)出嗜低溫弓形菌。PUIG等[10]報道1例西班牙兒童因食品污染導(dǎo)致嗜低溫弓形菌腸道感染，患兒應(yīng)用四環(huán)素類抗菌藥物治療完全恢復(fù)正常。BRüCKNER等[11]報道在德國門診和住院患者糞便樣本中，弓形桿菌屬主要分離鑒定出布氏弓形菌和嗜低溫弓形菌，對布氏弓形菌感染，環(huán)丙沙星可能作為首選藥物。本例患兒有溺糞病史，嗜低溫弓形菌存在于污水中，接觸污水是一種潛在的感染方式[6,12]，患兒可能出現(xiàn)血流感染。弓形菌屬在代謝上呈惰性，生長緩慢，很難通過生化測試來鑒定，因此對不同種的區(qū)分更多依靠分子生物學(xué)方法[1,6]。本研究采用MALDI-TOF MS對菌株進行分離鑒定，鑒定結(jié)果顯示該分離株與已知菌庫中嗜低溫弓形菌一致，分值為1.907，鑒定為嗜低溫弓形菌。由于缺乏針對弓形菌耐藥性的檢測標(biāo)準(zhǔn)，造成目前對于弓形菌耐藥性的真實判斷難度較大[7]。王晨希[13]研究顯示嗜低溫弓形菌對常見的氨芐青霉、頭孢菌素類表現(xiàn)出較強的耐藥性。VAN DEN ABEELE 等[14]報道在梯度擴散法中觀察到嗜低溫弓形菌對氟喹諾酮類藥物較高耐藥性。FERA等[15]報道體外試驗中亞胺培南是最有效的β-內(nèi)酰胺類藥物，頭孢菌素中頭孢吡肟表現(xiàn)出較高抗菌活性，而青霉素、氯霉素、萬古霉素具有高水平耐藥性。本研究因患兒放棄治療未能進行相關(guān)藥敏試驗。

目前來自不同國家關(guān)于弓形菌屬引起感染的報道越來越多，但仍然沒有直接與這種病原體的感染和發(fā)病相關(guān)的毒力因子報道[16-17]。我國嗜低溫弓形菌人體感染的相關(guān)報道較少，對于嗜低溫弓形菌的抗感染治療尚無經(jīng)驗可借鑒。本患兒因溺糞昏迷，患兒在糞池中窒息，嗜低溫弓形菌可經(jīng)過呼吸道進入患者體內(nèi)導(dǎo)致菌血癥，引發(fā)人體感染。臨床醫(yī)師對于有溺水、溺糞經(jīng)歷的患者，應(yīng)該警惕該細(xì)菌感染可能。