纖維蛋白(原)降解產物與D-二聚體最適比例可信區(qū)間的探討*

黃珣鋇，劉超男，凌莉琴，廖 娟，周 靜

四川大學華西醫(yī)院實驗醫(yī)學科，四川成都 610041

纖維蛋白(原)降解產物(FDP)是纖溶酶降解纖維蛋白原和纖維蛋白形成的產物，為纖維蛋白原降解產物(FgDP)和纖維蛋白降解產物(FbDP)的統(tǒng)稱[1-2]。D-二聚體(D-D)是纖溶酶介導的交聯(lián)纖維蛋白降解的最終產物[3]，由兩個共價結合的纖維蛋白D結構域組成[4-5]。臨床上常聯(lián)合檢測FDP和D-D，來判斷某些由于凝血和纖溶失衡而導致的疾病，理論上D-D是FDP的一部分[2]，F(xiàn)DP 水平應大于 D-D 水平，當出現(xiàn)D-D水平大于FDP水平的情況時(即FDP與D-D比例倒置)，可能是由于D-D假陽性或者FDP假陰性造成，近年來已經有多篇文獻報道了D-D假陽性的現(xiàn)象，并給出了相應的解決措施[4,6-8]。依據(jù)其生成原理，兩者之間應存在某種比例關系，超出比例范圍時需警惕FDP假陽性或者D-D假陰性，這種情況如何界定成為了擺在檢驗醫(yī)師面前的一道難題，且目前尚缺乏相關的研究探索FDP/D-D的最適比例。本研究旨在通過大樣本數(shù)據(jù)分析FDP/D-D的最適比例可信區(qū)間(CI)，以幫助檢驗醫(yī)師發(fā)現(xiàn)FDP和(或)D-D假陽(陰)性樣本，并排除可能干擾FDP和(或)D-D檢測的潛在影響因素，力求得到相對準確的檢驗結果，進一步優(yōu)化臨床報告質量，提高臨床醫(yī)生和患者滿意度。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析四川大學華西醫(yī)院2019年1月至2020年12月同時進行FDP和D-D檢測的報告206 879份，作為FDP/D-D最適比例CI建立組。納入標準：FDP和D-D均在線性范圍內(FDP在2.5～80 μg/mL；D-D在0.16～5.16 μg/mL FEU)。排除標準：FDP和D-D同時位于正常參考范圍以內的樣本，即FDP<5 μg/mL，D-D<0.5 μg/mL FEU。選取四川大學華西醫(yī)院2021年3月同時進行FDP和D-D檢測的樣本1 022例，作為最適比例CI驗證組。排除標準：FDP和D-D同時位于正常參考范圍以內的樣本，即FDP<5 μg/mL，D-D<0.5 μg/mL FEU。

1.2儀器與試劑 儀器為日本Sysmex公司CS5100全自動凝血分析儀，D-D檢測試劑盒(INNOVANCE D-Dimer)由德國Siemens公司生產，檢測原理為免疫比濁法；FDP測定試劑盒(配套試劑，Latex Test BL-2 P-FDP)購自日本BIOLINKS CO.,LTD公司，檢測原理為免疫比濁法。建立組和驗證組使用的D-D和FDP試劑批號有所不同，批號更換前均進行新舊批號比對，比對驗證通過后方可使用；樣本檢測當日，D-D和FDP室內質控均在控。FDP檢測試劑盒(驗證試劑)換用其他廠家檢測試劑，檢測原理為乳膠增強免疫比濁法，樣本檢測當日，F(xiàn)DP室內質控在控。

1.3方法

1.3.1FDP/D-D最適比例CI的建立 將建立組數(shù)據(jù)按照D-D水平分為以下3組：<0.5 μg/mL FEU組、0.5～<2.5 μg/mL FEU組和≥2.5 μg/mL FEU組，建立3個組的95%CI，區(qū)間以內的樣本定義為正常比值樣本；區(qū)間以外的樣本定義為異常比值樣本，可能由于FDP和(或)D-D出現(xiàn)假陽(陰)性造成。

1.3.2FDP/D-D最適比例CI的驗證 稀釋法：對驗證組中FDP≥5 μg/mL和D-D≥0.5 μg/mL FEU的樣本均采用機內稀釋模式進行稀釋，根據(jù)FDP和D-D稀釋前后結果分別計算FDP和D-D結果的偏差，偏差=(稀釋后-稀釋前)/稀釋前×100%，偏差絕對值(|偏差|)>15%[1/2總允許誤差(TEa)]則認為差異具有統(tǒng)計學意義。更換驗證試劑法：雖然稀釋前后結果|偏差|<15%，但FDP/D-D超過最適比例CI且結合臨床信息高度懷疑FDP假陽性的樣本，更換FDP驗證試劑后重新檢測。將稀釋法|偏差|>15%和更換驗證試劑后FDP/D-D位于最適比例CI的樣本均定義為陽性樣本。采用效能指標(靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值)評價本研究建立的最適比例CI在驗證數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)陽性樣本能力。

2 結 果

2.1FDP/D-D最適比例CI的建立 將建立組206 879例數(shù)據(jù)分為3組，3組數(shù)據(jù)FDP/D-D的分布及最適比例CI見表1。

表1 各組FDP/D-D的最適比例CI

2.2驗證組線性范圍內樣本FDP/D-D最適比例CI驗證情況及效能評價 驗證組中767例樣本FDP、D-D均位于線性范圍以內，但3個組別中分別有60.00%(3/5)、4.37%(25/572)和8.95%(17/190)樣本FDP/D-D不在已建立的相應組別FDP/D-D最適比例CI。在FDP/D-D異常樣本中分別有100.00%(3/3)、24.00%(6/25)和29.41%(5/17)樣本為陽性樣本，見表2。其中有5例樣本FDP/D-D明顯增高，見表3。雖然FDP稀釋前后|偏差|<15%，但進一步了解患者無肝腎功能異常、無異常出血和血栓表現(xiàn)、無纖溶異常家族史，故更換FDP驗證試劑重新檢測FDP，結果明顯降低。

表2 線性范圍內FDP/D-D最適比例CI驗證情況及效能評價

表3 FDP/D-D明顯增高的5例樣本情況

2.3驗證組超線性范圍樣本FDP/D-D最適比例CI驗證情況及效能評價 驗證組中有255例樣本超過檢測范圍，根據(jù)D-D≥2.5 μg/mL FEU時FDP/D-D最適比例CI，該群樣本中有26.27%(67/255)樣本FDP/D-D異常，異常的樣本中有83.58%(56/67)的陽性樣本，16.42%(11/67)的陰性樣本。對于線性范圍以外的結果即使FDP/D-D正常，仍有35.11%(66/188)的陽性樣本漏檢。采用FDP/D-D范圍判斷樣本是否正常的靈敏度為45.90%(56/122)，特異度為91.73%(122/133)，陽性預測值為83.58%(56/67)，陰性預測值為64.89%(122/188)。

2.4D-D和FDP檢測流程圖及處置建議 根據(jù)本研究，本課題組推薦使用以下流程判斷和處置FDP和D-D結果，見圖1。

注：*D-D檢測線性范圍上限依據(jù)各實驗室檢測試劑品牌不同、批號不同自行確立。圖1 D-D和FDP檢測流程圖及處置建議

3 討 論

D-D是交聯(lián)纖維蛋白在纖溶酶作用下的降解產物，F(xiàn)DP是纖維蛋白(原)的降解產物，兩者聯(lián)合檢測有助于鑒別原發(fā)性纖溶亢進和繼發(fā)性纖溶亢進，同時FDP和D-D作為纖溶標志物也用于彌散性血管內凝血(DIC)的診斷[9-10]。目前，臨床上用于檢測FDP和D-D的方法較多，包括乳膠凝集法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫膠體金法、免疫比濁法等[11]。其中，免疫比濁法有著操作簡便快速、靈敏度高、定量準確等優(yōu)點，已廣泛應用于多種全自動凝血分析儀[12]，其檢測原理基于抗原抗體反應，抗原抗體比例失調、膽紅素[13]、異嗜性抗體[14]、類風濕因子[8]或其他蛋白[15]等干擾均可能影響檢測準確性，導致假陽性結果，從而影響臨床醫(yī)生的診斷，延誤患者的病情。本研究通過對大量歷史數(shù)據(jù)的回顧性分析，建立了FDP/D-D最適比例CI，以幫助臨床發(fā)現(xiàn)潛在的影響因素最終降低干擾獲得相對準確的檢測結果。

由于D-D水平的高低會導致FDP/D-D范圍的差異較大，且D-D不同水平在國際血栓與止血學會(ISTH)的DIC診斷中積分不同[9-10]，同時結合D-D在靜脈血栓栓塞(VTE)疾病中的陰性排除標準D-D<0.5 μg/mL FEU，本研究分別以0.5 μg/mL FEU和2.5 μg/mL FEU的D-D水平將數(shù)據(jù)分為低、中、高3個組別建立FDP/D-D最適比例CI。

FDP和D-D的定量檢測方法使其檢測結果與稀釋倍數(shù)呈現(xiàn)一定的比例關系，當存在干擾物質時，稀釋可降低部分干擾因素，使其比例關系消失，稀釋后結果更接近樣本的真實值。本研究利用FDP和D-D稀釋前后的偏差是否超過TEa的1/2(均為15%)作為評價是否存在稀釋效應的標準，當稀釋法無效時，再采用更換不同檢測系統(tǒng)或檢測試劑等方法解決。

對于檢測結果位于線性范圍以內的數(shù)據(jù)，本研究建議FDP和D-D同時位于正常參考范圍以內時無須比例驗證，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計時亦已剔除。根據(jù)已建立的FDP/D-D區(qū)間，驗證數(shù)據(jù)位于線性范圍以內且FDP/D-D正常的722例樣本中，僅有5例(0.69%)陽性樣本被遺漏，特異度可達95.86%；比值異常的45例樣本中有14例陽性標本，靈敏度為73.68%。但需要注意的是，并非所有陽性樣本都可以通過稀釋發(fā)現(xiàn)。本研究樣本中，有5例樣本FDP/D-D增高明顯，但FDP稀釋前后|偏差|<15%，根據(jù)該檢測結果提示患者存在原發(fā)性纖溶亢進。經查閱患者病歷，5例患者肝、腎功能均正常、無異常出血表現(xiàn)、無纖溶異常家族史。結合FDP檢測原理，考慮到FDP包含的纖維蛋白降解片段長短不一，不同品牌試劑所包被的單克隆抗體針對的抗原靶位會存在不同，對應檢出的FDP片段(X、Y、D、E等碎片)也會有所差異。當患者體內存在一些與被檢物質活性相似但化學結構不同的物質時，容易造成假陽性的結果[16]，此時稀釋法不能有效降低此類干擾，應更換不同品牌的FDP試劑重新檢測。更換檢測試劑后，該5例樣本的FDP結果明顯降低，若僅依據(jù)線性范圍來判斷結果的準確性，很容易將此類FDP假性增高的樣本漏檢，發(fā)放不正確的報告，讓臨床醫(yī)生做出原發(fā)性纖溶亢進的誤診結果，導致不當?shù)脑\療。依據(jù)本研究建立的FDP/D-D最適比例CI給出以下處理建議：對于FDP和D-D均位于線性范圍的樣本，當D-D<0.5 μg/mL FEU，F(xiàn)DP/D-D>40.00時，建議更換不同廠家FDP試劑驗證；當D-D為0.5～<2.5 μg/mL FEU，F(xiàn)DP/D-D>7.25時，F(xiàn)DP假陽性可能性較大，但不排除弱的干擾因素影響，此時建議更換不同廠家FDP試劑或對FDP和D-D進行稀釋；當D-D為2.5～<5.16 μg/mL FEU時，若FDP/D-D<1.47則D-D假陽性可能性大，建議對D-D進行稀釋；若FDP/D-D>3.94則FDP假陽性可能性較大，建議對FDP和D-D進行稀釋。

由于部分實驗室使用的D-D試劑線性范圍較窄，臨床中采用了延長D-D檢測標準曲線的方法，通過人為增加D-D線性范圍來減少臨床稀釋復檢的頻率，對此，本研究也進行了相關驗證。在驗證組中有255例樣本FDP或D-D位于線性范圍外，通過對上述樣本進行稀釋發(fā)現(xiàn)，比值正常的188例樣本中仍有66例陽性樣本漏檢，但是驗證組FDP和D-D位于線性范圍內的767例樣本中僅5例漏檢，進一步提示使用延長檢測標準曲線的方法獲得的檢測結果不準確，由此計算得到的FDP/D-D會降低發(fā)現(xiàn)FDP和(或)D-D結果異常的陰性預測值(由99.31%降至64.89%)。故當FDP或D-D檢測結果超過標準曲線的線性范圍時，應該對所有樣本稀釋后再進行檢測，否則可造成FDP和(或)D-D假陽(陰)性，更可能導致FDP和(或)D-D的檢測錯誤。

綜上所述，聯(lián)合檢測FDP和D-D，同時結合FDP/D-D更有利于辨別兩者檢測結果的準確性。當FDP和D-D均位于線性范圍以內時，可以參照不同D-D水平對應的最適比例CI發(fā)現(xiàn)FDP/D-D異常的樣本，并采取相應處理措施，及時糾正FDP假性增高的情況；而當FDP或D-D位于線性范圍以外時，利用人為增加D-D線性范圍的方式獲得的結果可能較真值偏差較大，建議通過稀釋使其位于線性范圍以內再行判斷，可以較好地發(fā)現(xiàn)FDP和(或)D-D假陽(陰)性樣本，避免由于檢測結果的不準確，延誤臨床診療。