血清外泌體miR-21靶向PTEN激活PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的機(jī)制分析*

張 茜，同立宏，馬紅霞

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆烏魯木齊 830002

肺癌是常見且病死率較高的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居惡性腫瘤之首，根據(jù)病理特征可將其分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，肺癌的治療除了傳統(tǒng)的手術(shù)和放化療外，一些針對經(jīng)典腫瘤靶點(diǎn)的藥物及針對免疫檢查點(diǎn)類藥物的成功研發(fā)均為肺癌的治療提供了幫助，但是肺癌患者5年生存率仍然較低，約為15%[1-3]，因此探討肺癌發(fā)生機(jī)制，研究新型治療手段對于肺癌患者至關(guān)重要。腫瘤外泌體是一類由腫瘤細(xì)胞分泌的納米級囊泡，可存在于血液、唾液、淚液等體液中，外泌體內(nèi)含多種遺傳物質(zhì)，包括微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、DNA、環(huán)狀RNA(circRNA)等，其中血清外泌體中miRNA與腫瘤的病理機(jī)制密切相關(guān)，并且具有用于腫瘤診斷和治療的潛力[4-5]。有研究顯示，miR-21在肺癌中高表達(dá)[6]，亦有學(xué)者報道，miR-21可誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的形成而促進(jìn)肺癌的發(fā)展[7]，亦可調(diào)控蛋白激酶B(AKT)/磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)/半胱氨酸蛋白酶3/基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2/MMP-9信號通路而促進(jìn)肺癌的生長和轉(zhuǎn)移[8]。本文探討了血清外泌體中miR-21的表達(dá)水平，以及對肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集20例肺癌患者的血液標(biāo)本以及18例健康志愿者血液標(biāo)本。肺癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)活檢標(biāo)本病理檢查確診為肺癌、未接受過手術(shù)、化療、放療等治療，本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。人肺癌細(xì)胞A549(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；Transwell小室(購自美國Corning公司)；CCK8試劑盒(沈陽萬類生物技術(shù)有限公司)；蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)、磷酸化磷酸酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、PI3K、p-AKT、AKT、CD9、CD63、TSG101、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗、IgG二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，雙熒光素酶報告基因試驗(yàn)檢測試劑盒(英國Abcam公司)，Trans ExoTM Serum/Plasma Exosome Kit(北京全式金科技有限公司)，ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit(德國QIAGEN公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-21組(轉(zhuǎn)染miR-21 mimic)和miR-21+PTEN組(轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后再轉(zhuǎn)染PTEN質(zhì)粒)，Normal exo組(A549細(xì)胞與10 μg/mL Normal exo共孵育48 h)、LCA exo組(A549細(xì)胞與10 μg/mL LCA exo共孵育48 h)、LCA exo+PTEN組(A549細(xì)胞與10 μg/mL LCA exo共孵育48 h后轉(zhuǎn)染PTEN質(zhì)粒)、PBS組(A549細(xì)胞中加入等體積PBS培養(yǎng)48 h)。按照上述分組，使用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2外泌體提取與鑒定 將20例肺癌患者的血液標(biāo)本及18例健康志愿者血液標(biāo)本置于無菌試管中，放置30 min取上層血清，血清外泌體提取使用TransExoTMSerum/Plasma Exosome Kit試劑盒。在透射電鏡下觀察外泌體的結(jié)構(gòu)，Western blot鑒定外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101。

1.2.3qRT-PCR 使用ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit提取血清外泌體miRNA，使用miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒和EvaGreen miRNA qRCR MasterMix試劑盒進(jìn)行miR-21逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qRT-RCR反應(yīng)，使用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-21表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.2.4雙熒光素酶報告基因試驗(yàn) TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-21與PTEN結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建PTEN野生型(pGL3-PTEN WT組)、突變型質(zhì)粒(pGL3- PTEN MUT組)及空白質(zhì)粒(pGL3-control組)，并使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞，再用RNA轉(zhuǎn)染試劑將miR-21 mimic和miR-NC轉(zhuǎn)染至上述293T細(xì)胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.5CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染后或者與外泌體孵育后的各組A549細(xì)胞接種至96孔板，每孔1 000個/100微升，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、72 h后，取出對應(yīng)的96孔板，每孔加入10 μL的CCK8溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值(A值)。

1.2.6Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 取各組A549細(xì)胞用RPMI-1640空白培養(yǎng)基稀釋，然后以10 000個/200微升接種至Transwell小室中(或鋪Matrigel膠的Transwell小室)，小室置于600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640的24孔板中，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中72 h，取出后用PBS清洗小室，底部滴加無水甲醛固定30 min，底部滴加結(jié)晶紫溶液染色10 min，清洗小室，晾干，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7Western blot檢測PTEN蛋白表達(dá) 取各組A549細(xì)胞1×104個加入200 μL RIPA冰上裂解30 min，12 000 r/min，離心15 min，取上清液為細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取10 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，PVDF膜與PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、CD9、CD63、TSG101抗體4 ℃過夜孵育，TBST洗膜后，二抗室溫孵育1.5 h，洗膜后用ECL試劑盒顯影，拍照，用Image J軟件對曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1外泌體的鑒定結(jié)果 透射電鏡觀察到Normal exo組和LCA exo組外泌體粒徑在30～100 nm，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，呈“杯托”樣，并且表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101。見圖1、圖2。

圖1 透射電鏡鑒定外泌體

圖2 Western blot鑒定外泌體

2.2肺癌患者血清外泌體中miR-21高表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與Normal exo組比較，LCA exo組中miR-21表達(dá)上調(diào)(P<0.001)。見圖3。

注：***P<0.001。圖3 qRT-PCR檢測Normal exo組和LCA exo組中miR-21的表達(dá)

2.3PTEN為miR-21的靶基因 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，pGL3-PTEN WT組293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后相對熒光強(qiáng)度低于轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞(P<0.001)，而pGL3-PTEN MUT組293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-21 mimic后相對熒光強(qiáng)度無明顯變化。Western blot檢測結(jié)果顯示，相比于miR-NC組，miR-21組A549細(xì)胞PTEN表達(dá)水平下調(diào)(P<0.001)。見圖4。

注：A為數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-21和PTEN mRNA的靶向結(jié)合位點(diǎn)；B為雙熒光素酶報告基因試驗(yàn)；C為Western blot檢測miR-21對PTEN蛋白表達(dá)的影響；與miR-NC組比較，***P<0.001。圖4 miR-21靶向抑制PTEN表達(dá)

2.4miR-21靶向PTEN促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移能力 CCK8、細(xì)胞遷移和侵襲檢測結(jié)果顯示，相比于miR-NC組，miR-21組A549細(xì)胞在24、48、72 h的A值顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著增加(P<0.001)；相比于miR-21組，miR-21+PTEN組細(xì)胞在48、72 h的A值顯著下降(P<0.01)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著減少(P<0.001)。見圖5。

注：A為3組細(xì)胞在不同時間點(diǎn)的A值變化情況；B為顯微鏡觀察3組細(xì)胞遷移和侵襲情況(×20)；C為3組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)的比較。與miR-NC組比較，***P<0.001；與miR-21組比較，###P<0.001。圖5 miR-21靶向PTEN抑制肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移能力

2.5肺癌患者血清外泌體轉(zhuǎn)移miR-21至肺癌細(xì)胞情況 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，相比于PBS組，LCA exo組A549細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.001)，而Normal exo組A549細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平與PBS組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明肺癌患者血清外泌體可轉(zhuǎn)移miR-21至肺癌細(xì)胞中。見圖6。

注：與PBS組比較，***P<0.001。圖6 qRT-PCR檢測各組A549細(xì)胞中miR-21表達(dá)

2.6血清外泌體傳遞miR-21調(diào)控PTEN表達(dá)而促進(jìn)肺癌的生長和轉(zhuǎn)移能力 CCK8、Transwell及Western blot檢測結(jié)果顯示，與PBS組比較，LCA exo組A549細(xì)胞A值在24、48、72 h顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著增加(P<0.001)，PTEN表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.001)，而Normal exo組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及PTEN表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LCA exo+PTEN組A549細(xì)胞PTEN表達(dá)上調(diào)(P<0.001)，A值在24、48、72 h顯著低于LCA exo組(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著低于LCA exo組(P<0.001)，說明血清外泌體miR-21調(diào)控PTEN表達(dá)而促進(jìn)肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。見圖7。

注：A為Western blot檢測4組細(xì)胞PTEN表達(dá)情況；B為4組細(xì)胞PTEN相對表達(dá)水平的比較；C為4組細(xì)胞在不同時間點(diǎn)的A值變化情況；D為顯微鏡觀察4組細(xì)胞遷移和侵襲情況(×20)；E為4組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)的比較;與PBS組比較，***P<0.001；與LCA exo組比較，###P<0.001。圖7 LCA exo可抑制PTEN表達(dá)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移

2.7血清外泌體傳遞miR-21靶向PTEN而激活PI3K/AKT信號通路 與PBS組比較，LCA exo組A549細(xì)胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT顯著增加(P<0.001)，而Normal exo組無顯著變化；與LCA exo組比較，LCA exo+PTEN組A549細(xì)胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT顯著降低(P<0.001)，提示LCA exo可通過轉(zhuǎn)移miR-21調(diào)控A549細(xì)胞PTEN表達(dá)而激活PI3K/AKT信號通路。見圖8。

A為Western blot檢測4組細(xì)胞p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT表達(dá)水平；B為4組細(xì)胞p-PI3K/PI3K的比較；C為4組細(xì)胞p-AKT/AKT的比較；與PBS組比較，***P<0.001；與LCA exo組比較，###P<0.001。圖8 LCA exo抑制PTEN激活PI3K/AKT信號通路

3 討 論

外泌體是一類由多種活細(xì)胞分泌的納米級囊泡，可在生理狀態(tài)下和病理狀態(tài)下調(diào)控機(jī)體的生長發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展，外泌體可存在于血液、腦脊液、腹水、唾液等體液中[9-10]。外泌體內(nèi)含多種遺傳物質(zhì)，如miRNA、lncRNA、circRNA等。其中，外泌體miRNA在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮多種生物學(xué)調(diào)控功能。研究表明，經(jīng)化療后的肺癌患者血清外泌體中miR-208a高表達(dá)，而抑制P21/AKT/mTOR信號通路，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移及化療耐受[11]。亦有研究表明，非小細(xì)胞肺癌患者血清外泌體中miR-17-5p表達(dá)高于健康人血清外泌體，外泌體miR-17-5p具有用于非小細(xì)胞肺癌診斷的潛力，將其與傳統(tǒng)標(biāo)志物聯(lián)合使用，以提高肺癌早期診斷的靈敏度和特異度[12]。

肺癌患者血清外泌體中的miRNA能夠作為肺癌診斷和治療的新型靶點(diǎn)，有研究顯示，肺癌患者血清外泌體中miR-96作為預(yù)測順鉑耐藥的標(biāo)志物，從而為肺癌患者提供更精準(zhǔn)的治療方案，miR-96的靶向抑制劑可改善肺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥情況[13]。miR-21已經(jīng)被報道可調(diào)控肝癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤的進(jìn)展，如腫瘤微環(huán)境中外泌體miR-21可誘導(dǎo)早期肝癌的轉(zhuǎn)移，miR-21可靶向PTEN而促進(jìn)卵巢癌的增殖和遷移，亦可作為乳腺癌診斷的潛在靶點(diǎn)[14-16]。在肺癌中，miR-21可調(diào)控脂肪酸的代謝而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖[17]，也可調(diào)控 PTEN/AKT/GSK3β信號通路而促進(jìn)肺癌的生長和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[18]。本研究首先提取并鑒定了來自健康志愿者和肺癌患者血清中的外泌體，然后檢測發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清外泌體中miR-21表達(dá)增加，在肺癌細(xì)胞A549中轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均顯著增加，說明miR-21具有促進(jìn)肺癌生長和轉(zhuǎn)移的能力。miRNA是一類可調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的RNA，其調(diào)控機(jī)制在靶向結(jié)合與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)域，而抑制靶基因的翻譯[19]。本研究通過雙熒光素酶報告基因試驗(yàn)驗(yàn)證了PTEN為miR-21的靶基因，并且發(fā)現(xiàn)miR-21可抑制PTEN表達(dá)來促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血清外泌體可轉(zhuǎn)移miR-21至A549細(xì)胞中而促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，但是將與外泌體共孵育的A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染PTEN質(zhì)粒后，細(xì)胞的增殖遷移和侵襲能力均下降，說明肺癌患者血清外泌體可通過轉(zhuǎn)移miR-21調(diào)控PTEN的表達(dá)而影響細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移能力。

PI3K/AKT信號通路是調(diào)控肺癌的重要信號通路，研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路可作為非小細(xì)胞肺癌的治療靶點(diǎn)[20]，PI3K/AKT信號通路抑制劑可顯著抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展[21]，亦可誘導(dǎo)腫瘤血管新生而促進(jìn)腫瘤的生長[22]。PTEN作為PI3K/AKT信號的調(diào)控因子，可抑制PI3K和AKT的磷酸化水平而抑制PI3K/AKT信號通路，進(jìn)而抑制腫瘤的生長[23]。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清外泌體和miR-21可顯著提高p-PI3K和p-AKT水平，即激活PI3K/AKT信號通路，而過表達(dá)PTEN可抑制外泌體對該通路的激活。

綜上所述，血清外泌體能夠通過傳遞miR-21而調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號通路，進(jìn)而促進(jìn)肺癌的生長和轉(zhuǎn)移，但是其在臨床診斷和治療的應(yīng)用還需進(jìn)一步探究。