B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及對患者生存時間的預(yù)測*

李 強(qiáng)，黃思宇△，閔 倩，張洪濤，謝 猛

安徽省阜陽市第二人民醫(yī)院：1.腫瘤科；2.檢驗(yàn)科，安徽阜陽 236015

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。該病每年的發(fā)病率約為17/10 000，嚴(yán)重影響了患者的健康和安全，并給患者家屬造成了巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。目前，胃癌的臨床療效不顯著，預(yù)后不良，尤其是進(jìn)展期胃癌。盡管部分患者進(jìn)行了根治性胃切除術(shù)，但5年生存率僅為20%左右，因此，對胃癌發(fā)病機(jī)制的研究有助于提高臨床療效和改善預(yù)后[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌可由多種復(fù)雜的內(nèi)、外因素引起，這些因素導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和基因表達(dá)異常，胃癌的發(fā)生和發(fā)展可能與多種癌基因和淋巴細(xì)胞(包括B細(xì)胞)的激活以及抑癌基因的失活有關(guān)[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)屬于CD4+Treg亞群，與腫瘤免疫抑制有一定關(guān)系，其可以調(diào)節(jié)CD4+和CD8+的激活和增殖，并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[4]。目前，關(guān)于Treg與胃癌病理特征相關(guān)性的研究較少?；诖耍疚闹饕接懥薆細(xì)胞、CD4+CD25+Treg的表達(dá)與胃癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并分析了上述細(xì)胞表達(dá)情況對患者預(yù)后生存時間的預(yù)測價值，旨在為臨床胃癌的診斷和治療提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2017年12月本院收治的胃癌患者80例作為胃癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)通過胃鏡或病理檢查證實(shí)為胃癌；(2)入組前未進(jìn)行放化療；(3)臨床資料完整；(4)所有患者均知情同意參與本研究；(5)均無認(rèn)知障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)凝血功能異常；(3)無法完成本研究所有檢查項(xiàng)目；(4)檢查結(jié)果無效；(5)中途退出研究。胃癌組中男52例，女28例；年齡35～75歲，平均(50.12±5.23)歲；腫瘤最大徑：≤5 cm共38例，>5 cm共42例；TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期12例，Ⅲ期40例，Ⅳ期8例；分化程度：高分化13例，中分化23例，低分化44例；腫瘤位置：胃體41例，幽門及胃竇19例，賁門及胃底20例；病理類型均為胃腺癌，其中管狀腺癌33例，乳頭狀腺癌27例，黏液腺癌20例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)28例。選取同期在本院體檢的健康者50例作為對照組，其中男32例，女18例；年齡35～75歲，平均(51.03±6.02)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1B細(xì)胞水平的檢測 將正常胃組織和胃癌組織獲得的淋巴細(xì)胞調(diào)到2×109/L后進(jìn)行離心，在試管中加入40 μL CD4+試劑和40 μL CD19+試劑，重懸，室溫下避光孵育15 min；磷酸鹽緩沖液洗滌后，用流式細(xì)胞儀檢測并用軟件分析。

1.2.2CD4+CD25+Treg比例的檢測 采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血5 mL，肝素抗凝后，用梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，用不含胎牛血清1640培養(yǎng)基洗滌兩次，然后用含1%胎牛血清的完全1640培養(yǎng)基進(jìn)行重塑，接著將淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)并稀釋至1×106/mL，取1 mL細(xì)胞懸液于試管中，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，分別將20 μL異硫氨酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD4抗體和20 μL熒光素PE標(biāo)記的CD25抗體在4 ℃冰箱中暗孵30 min，然后離心，用1%胎牛血清蛋白-磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，稀釋至300 μL；用貝克曼庫爾特Gallios流式細(xì)胞儀(蘇州賽恩斯儀器有限公司)測定淋巴細(xì)胞表面各熒光素的熒光強(qiáng)度，并用空白和陰性對照消除非特異性和自發(fā)熒光。每次分析10 000個細(xì)胞，用二維dot-p1ot散點(diǎn)圖保存，在FITC-CD4/PE-CD25雙參數(shù)圖上計(jì)算CD4+CD25+Treg比例，CD4+CD25+Treg比例=CD4+CD25+Treg/CD4+Treg×100%。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較兩組外周血B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例；(2)比較不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例的差異；(3)分析B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系；(4)記錄所有胃癌患者隨訪的生存情況。所有患者隨訪3年，共失訪2例，胃癌組失訪1例，對照組失訪1例，失訪原因均為更換聯(lián)系方式或聯(lián)系方式錯誤。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例比較 胃癌組外周血B細(xì)胞水平低于對照組(P<0.05)，CD4+CD25+Treg比例高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組外周血B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例比較

2.2不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例比較 不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例比較

2.3B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者TNM分期的關(guān)系 以TNM分期(定義“Ⅰ期”=1，“Ⅱ期”=2，“Ⅲ期”=3，“Ⅳ期”=4)作為因變量，將不同TNM分期胃癌患者外周血B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例作為自變量，納入多元線性回歸模型，結(jié)果顯示，胃癌患者外周血B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例與TNM分期均存在相關(guān)性(P<0.05)，見表3。

表3 B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者TNM分期的關(guān)系

2.4B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(定義“是”=1，“否”=2)作為因變量，將不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者外周血B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例作為自變量，納入多元線性回歸模型，結(jié)果顯示，胃癌患者外周血B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均存在相關(guān)性(P<0.05)，見表4。

表4 B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.5B細(xì)胞對胃癌患者生存時間的預(yù)測 隨訪半年，B細(xì)胞低表達(dá)患者有62例，平均生存時間為(24.06±5.13)個月；高表達(dá)患者17例，平均生存時間為(34.09±5.22)個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6CD4+CD25+Treg細(xì)胞對胃癌患者生存時間的預(yù)測 CD4+CD25+Treg細(xì)胞高表達(dá)患者60例，平均生存時間為(23.17±5.09)個月；低表達(dá)患者19例，平均生存時間為(35.12±5.07)個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

胃癌常發(fā)生在胃黏膜和胃腺上皮中。最常見的組織學(xué)類型是腺癌，發(fā)生在胃竇的小彎曲處[5]。近年來，雖然全世界胃癌患者的發(fā)病率和病死率呈緩慢下降趨勢，但由于國內(nèi)人口老齡化較嚴(yán)重，新發(fā)胃癌患者數(shù)量仍居高不下，病死率仍處于我國疾病病死率的前列[6]。雖然約55%的胃癌患者在治療時僅表現(xiàn)為非特異性胃腸道消化不良，且在胃癌早期通常沒有明顯癥狀，大多數(shù)患者就診時已進(jìn)展到胃癌晚期，只能通過徹底的淋巴結(jié)清掃進(jìn)行保守治療[7]。晚期患者手術(shù)預(yù)后差，并發(fā)癥多，因此找到可預(yù)測其生存時間的指標(biāo)對于降低患者的病死率具有十分重要的臨床意義。

B細(xì)胞作為體液免疫的重要介導(dǎo)細(xì)胞，主要在抗原刺激下分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生免疫球蛋白(Ig)，參與體液免疫[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，被腫瘤組織浸潤的B細(xì)胞可以產(chǎn)生IgG抗體，識別腫瘤組織中的抗原并抑制其生長[9]。CD4+CD25+Treg是CD4+Treg亞群的成員，其可能導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低，以及白細(xì)胞介素-2水平升高，使抗CD3和抗CD28單克隆抗體的聯(lián)合作用處于無反應(yīng)狀態(tài)。此外，其還具有免疫抑制作用，表現(xiàn)為在細(xì)胞抗原受體接收激活的信號刺激后，抑制CD4+和CD8+細(xì)胞的活化和增殖[10]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg在預(yù)防免疫性疾病、抑制神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用[11]。其作用不依賴于細(xì)胞因子，而僅通過細(xì)胞間接觸[12-13]。目前，關(guān)于CD4+CD25+Treg與胃癌患者臨床特征的關(guān)系研究較少。探討其相關(guān)性有助于胃癌早期診斷、客觀評估病情，為臨床治療提供參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組外周血B細(xì)胞水平低于對照組(P<0.05)，CD4+CD25+Treg比例高于對照組(P<0.05)；本研究結(jié)果還顯示，不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均存在相關(guān)性(P<0.05)，提示B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例可對胃癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移產(chǎn)生一定的影響。相關(guān)研究結(jié)果顯示，在淋巴細(xì)胞性間質(zhì)性胃癌中，B細(xì)胞高浸潤組分化程度較高，TNM分期較低；EB病毒(EBV)陰性淋巴細(xì)胞間質(zhì)性胃癌中，B細(xì)胞高侵襲組TNM分期低于低侵襲組，提示B細(xì)胞可能有助于降低腫瘤TNM分期[14]。另有研究顯示，胃癌患者術(shù)前外周血CD4+CD25+Treg比例在不同TNM分期患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ⅲ期和Ⅳ期胃癌患者外周血CD4+CD25+Treg比例明顯高于Ⅰ期(P<0.05)，Ⅳ期胃癌患者外周血CD4+CD25+Treg比例也明顯高于Ⅱ期(P<0.05)，提示TNM分期越高，術(shù)前外周血CD4+CD25+Treg比例越高[15]。上述結(jié)果提示，在腫瘤進(jìn)展過程中，外周血中CD4+CD25+Treg的水平增加，說明外周血CD4+CD25+Treg可能影響腫瘤的進(jìn)展。另外，生存分析發(fā)現(xiàn)，不同B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例的胃癌患者的生存時間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg可作為預(yù)測胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，胃癌患者的外周血B細(xì)胞水平降低，CD4+CD25+Treg比例增加，胃癌患者外周血B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg比例與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均存在相關(guān)性，外周血B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg可作為預(yù)測胃癌患者預(yù)后情況的指標(biāo)。