微流控芯片環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)快速檢測8種腸道致病菌*

宋 娜，劉朝陽，李夢藍，王玉飛，楊曉莉，孫振學(xué)

解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心檢驗科,北京 100039

腸道是致病菌定植和感染的主要器官[1]。腸道致病菌主要是通過污染的食物或水進入消化道，并最終定殖在腸道內(nèi)引起感染性腹瀉等疾病[2]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年有17～50億人發(fā)生腹瀉，140萬人因腹瀉死亡[3-5]。志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、彎曲菌、致瀉型大腸埃希菌是引起腹瀉的主要致病菌。因此，快速、準確、靈敏地檢測出致病菌，對腹瀉的臨床診斷及用藥有重要的指導(dǎo)意義。

微流控芯片環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(LAMP)是一種新興的分子診斷技術(shù)[6]，它將微流控芯片的微型化、高通量、低污染、低成本等優(yōu)點與LAMP技術(shù)的簡便、快捷、高靈敏度等優(yōu)點相結(jié)合[7]，集成了一個新型的診斷技術(shù)。本文分別以志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌的特異性目的片段設(shè)計引物，利用微流控芯片LAMP技術(shù)，在反應(yīng)體系中加入熒光染料EvaGreen，在恒溫擴增過程中進行實時熒光監(jiān)測，建立8種腸道致病菌同步檢測的微流控芯片LAMP檢測方法?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株 實驗所用標(biāo)準菌株購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。具體菌株信息見表1。

表1 實驗用菌株

1.2試劑與儀器 反應(yīng)預(yù)混液(主要成分包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、EvaGreen)；細菌裂解液(北京熱景生物技術(shù)股份有限公司)；糞便提取試劑盒(北京熱景生物技術(shù)股份有限公司)；腸道致病菌微流控芯片(北京熱景生物技術(shù)股份有限公司)；微流控恒溫擴增PCR多重核酸檢測儀(北京熱景生物技術(shù)股份有限公司)。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計與合成 本文使用的志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌基因組DNA引物均由北京熱景技術(shù)股份有限公司提供。

1.3.2模板DNA的制備 吸取1 mL含有實驗菌株的培養(yǎng)液，加入到1.5 mL無菌離心管中，10 000 r/min離心2 min，盡量棄除上清液；加入100 μL細菌裂解液懸浮菌體，95 ℃加熱5 min，上清液即為待檢測DNA模板。

1.3.3恒溫擴增反應(yīng)體系配制 恒溫擴增反應(yīng)體系為90 μL，包括10 μL待檢測DNA模板、45 μL反應(yīng)預(yù)混液、35 μL DNase/RNase-Free去離子水。

1.3.4微流控芯片LAMP反應(yīng) 將恒溫擴增反應(yīng)體系加入腸道致病菌微流控芯片中，使用微流控恒溫擴增PCR多重核酸檢測儀進行恒溫擴增。以1×104CFU/mL的福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、大腸埃希菌混合菌液制備的基因組DNA為檢測靶標(biāo)測試擴增效率，以高壓滅菌水作為反應(yīng)條件特異性初篩模板，設(shè)置恒溫擴增溫度分別為60、63、65 ℃，反應(yīng)時間30 min。

1.3.5微流控芯片LAMP特異度實驗 提取福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、大腸埃希菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、阪崎腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、長雙歧桿菌、干酪乳桿菌的基因組DNA，采用1.3.3和1.3.4的反應(yīng)體系和擴增方法進行擴增，以此來驗證各個檢測引物的特異性是否滿足檢測要求。

1.3.6微流控芯片LAMP靈敏度實驗 用無菌生理鹽水分別將福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、大腸埃希菌的菌液稀釋至1×106、1×105、1×104、 1×103、1×102CFU/mL，并進行平板菌落計數(shù)。然后再將上述菌液混合稀釋至1×105、1×104、 1×103、1×102、1×101CFU/mL系列濃度，并分別對混合菌液的每個梯度進行模板DNA的制備，采用1.3.3和1.3.4的反應(yīng)體系和擴增方法進行檢測。

1.3.7模擬樣本的檢測 將福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、大腸埃希菌的菌液混合，稀釋至終濃度分別為1×105、1×104、1×103、1×102、1×101CFU/mL的混合致病菌菌液。取不同濃度的混合致病菌菌液1 mL分別加入黃豆粒大小的健康人糞便(約2.3 g)中，使用菌液將糞便懸浮混勻，4 ℃放置過夜，使細菌與糞便充分吸附，即為制備的模擬污染糞便樣本。每個濃度制備3份模擬污染糞便樣本，共制備15份，同時制備3份只加滅菌純化水的未被污染的模擬糞便樣本作為陰性對照。使用糞便提取試劑盒提取模擬糞便樣本DNA，采用1.3.3和1.3.4的反應(yīng)體系和擴增方法進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1反應(yīng)溫度優(yōu)化 在恒溫擴增反應(yīng)體系中，溫度不僅影響著擴增效率還直接關(guān)系著體系的特異性。溫度高時特異性強，但引物不能與模板牢固結(jié)合，擴增效率下降；溫度低時產(chǎn)量高，但可能造成引物與模板錯配，產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。因此，在保證特異性的前提下為了提高擴增效率，需要對恒溫擴增反應(yīng)體系進行溫度優(yōu)化，以選取最佳的反應(yīng)條件。綜合8種腸道致病菌，在65 ℃條件下，擴增效率最佳，檢出時間(CT)最短，且無非特異擴增產(chǎn)物。這表明在相同的時間內(nèi)，恒溫擴增反應(yīng)體系在65 ℃條件下有著更多的特異性產(chǎn)物，更有利于檢測。見表2。

表2 反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果(min)

2.2微流控芯片LAMP特異性分析 本研究分別將1.3.5提取的各菌液基因組DNA作為檢測模板，配制成恒溫擴增反應(yīng)體系并加入腸道致病菌微流控芯片中進行恒溫擴增，結(jié)果顯示，福氏志賀菌的基因組DNA在反應(yīng)孔2和10中顯示陽性，在其他反應(yīng)孔中均為陰性；鼠傷寒沙門菌的基因組DNA在反應(yīng)孔3和10中顯示陽性，在其他反應(yīng)孔中均為陰性；副溶血性弧菌的基因組DNA在反應(yīng)孔4和10中顯示陽性，在其他反應(yīng)孔中均為陰性；空腸彎曲菌的基因組DNA在反應(yīng)孔5和10中顯示陽性，在其他反應(yīng)孔中均為陰性；大腸埃希菌的基因組DNA在反應(yīng)孔6～10顯示陽性，在其他反應(yīng)孔中均為陰性；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的基因組DNA、阪崎腸桿菌的基因組DNA、單核細胞增生李斯特菌的基因組DNA、金黃色葡萄球菌的基因組DNA、銅綠假單胞菌的基因組DNA、肺炎克雷伯氏菌的基因組DNA、糞腸球菌的基因組DNA、長雙歧桿菌的基因組DNA、干酪乳桿菌的基因組DNA，均只有反應(yīng)孔10顯示陽性，在其他反應(yīng)孔中全部為陰性。以上結(jié)果說明8項致病菌的反應(yīng)體系均未與其他細菌出現(xiàn)交叉反應(yīng)，特異性好，同時也說明芯片的密閉性良好，各反應(yīng)孔之間獨立，無交叉反應(yīng)。說明建立的8種腸道致病菌微流控芯片LAMP能夠為臨床診斷提供可靠依據(jù)。

2.3微流控芯片LAMP靈敏度分析 為驗證LAMP對8種腸道致病菌的靈敏度，將提取的1×105、1×104、 1×103、1×102、1×101CFU/mL的混合菌液基因組DNA進行微流控芯片LAMP擴增。結(jié)果顯示，混合菌液濃度在1×102CFU/mL及以上時8種致病菌的熒光值均逐漸增強直至擴增完成，發(fā)生擴增反應(yīng)，即該方法對福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌的最低檢測限均為100 CFU/mL；并且隨著混合菌液濃度的降低，引物與模板接觸的可能性減少，導(dǎo)致反應(yīng)所需時間變長；當(dāng)混合菌液濃度為1×101CFU/mL時，因濃度太低與引物結(jié)合失敗而無法完成擴增反應(yīng)。

2.4模擬糞便樣本檢測 模擬糞便樣本中各致病菌的濃度分別為 1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、0 CFU/mL，提取基因組DNA后檢測。本實驗建立的微流控芯片LAMP對模擬糞便樣本中福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌的最低檢出限為100 CFU/mL；對空腸彎曲菌和腸聚集性大腸埃希菌的最低檢出限為1 000 CFU/mL，同時對滅菌純化水處理的糞便未檢出上述致病菌。對模擬糞便的檢測結(jié)果表明，微流控芯片LAMP能夠成功檢測糞便中的致病菌，且與對菌液的檢測時間一致，最快可在10 min內(nèi)獲得陽性判定結(jié)果，而對于最低檢出限濃度的糞便樣本，在30 min內(nèi)獲得陽性判定結(jié)果，整個過程不超過30 min。見表3。

表3 不同濃度模擬糞便樣本中各致病菌CT檢測結(jié)果(min)

3 討 論

無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，急性腹瀉仍然是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題[8]。志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌是腸道感染的常見致病菌，能夠經(jīng)過消化道傳播，引起局部暴發(fā)流行[9-10]。所以，亟需一種快速、準確、靈敏、便捷的檢測手段，用于檢測糞便樣本中的腸道致病菌群，預(yù)防疾病流行，并有效指導(dǎo)抗菌藥物的使用。

本研究通過優(yōu)化傳統(tǒng)的LAMP檢測方法，建立多通道微流控芯片LAMP，并采用對擴增反應(yīng)抑制較小的EvaGreen熒光染料來進行實時熒光監(jiān)測，實現(xiàn)了8種重要腸道病原體快速、特異、靈敏和一體化檢測。檢測結(jié)果顯示，志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌共8種致病菌可通過同一張芯片同時檢測。所需試劑量少，且微流控芯片LAMP無須進行變性、退火、延伸等復(fù)雜步驟即可實現(xiàn)擴增，與實時熒光定量PCR方法需要昂貴、精密實驗儀器相比，反應(yīng)成本低。同時，微流控芯片LAMP技術(shù)，靈敏度較高，芯片中8種致病菌的檢測靈敏度均為100 CFU/mL，比傳統(tǒng)LAMP方法靈敏度高出10倍左右[11]。在模擬糞便樣本中，福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌的最低檢出限均為100 CFU/mL，空腸彎曲菌和腸聚集性大腸埃希菌的最低檢出限為1 000 CFU/mL，優(yōu)于多重PCR檢測方法[12-13]。此外，這8種致病菌的擴增檢測可以在30 min之內(nèi)判定結(jié)果，比大部分相同靈敏度水平的分子生物學(xué)快速檢測方法用時短[14-15]。

本研究針對志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌的保守基因分別設(shè)計了一套特異性引物，使其適合于該8種致病菌的核酸診斷。此外，微流控芯片LAMP實現(xiàn)了全封閉操作，避免了氣溶膠的污染[16-17]。同時，在微流控芯片上還設(shè)置了內(nèi)參對照，可以監(jiān)控實驗過程是否正常，實現(xiàn)了擴增反應(yīng)體系的全封閉化和微量化，從而避免了人員操作造成的人為實驗污染，大大提高了檢測的準確性和特異度[12,18-19]。

綜上所述，針對志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸道致病性大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌設(shè)計引物并建立微流控芯片LAMP，可應(yīng)用于糞便樣本檢測。8種致病菌均能在30 min內(nèi)獲得陽性判定結(jié)果，且檢測靈敏度可達100 CFU/mL。模擬糞便樣本中福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌的最低檢測限可達100 CFU/mL；空腸彎曲菌和腸聚集性大腸埃希菌的最低檢出限為1 000 CFU/mL，說明微流控芯片LAMP具有用時短、反應(yīng)快、特異度和靈敏度高且操作簡單等特點，從而使病原微生物床旁檢測(POCT)成為可能。