固相萃取—高效液相色譜質(zhì)譜法對環(huán)境水樣中沙星類化合物的分析

成曉葉，牛 禾，冀雅茹，陳 怡，魏文婉，陳 昊，余彬彬

（1.臺州學(xué)院醫(yī)藥化工與材料工程學(xué)院，浙江 臺州 318000；2.浙江省臺州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，浙江 臺州 318000）

0 引言

沙星類化合物是一類重要而成功的合成抗生素，廣泛應(yīng)用于人類、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖，具有抗菌譜廣、口服吸收好、成本低等優(yōu)點(diǎn)。 沙星類化合物主要指喹諾酮類化合物或喹諾酮類抗生素，其作用于細(xì)菌DNA，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶，具有強(qiáng)而快速的抗菌作用。由于喹諾酮類藥物被廣泛用于治療各種疾病，這就使得沙星類化合物被排泄到自然環(huán)境中，導(dǎo)致全球公共衛(wèi)生威脅日益增加。據(jù)報(bào)道，沙星類化合物主要存在于醫(yī)院污水處理物、污水處理廠、河流甚至飲用水中[1]。

隨著大量沙星類化合藥物的使用，水產(chǎn)品體內(nèi)也有沙星類藥物及其代謝產(chǎn)物的殘留，并隨著水產(chǎn)品的代謝產(chǎn)物排入水環(huán)境中[2]。而其在水環(huán)境中的存在有可能改變水環(huán)境中微生物的結(jié)構(gòu)，即使是微量化合物的存在也可導(dǎo)致環(huán)境中細(xì)菌抗藥性的增強(qiáng)、抗病菌種的出現(xiàn)及人畜交叉耐藥性等[3]，即生態(tài)系統(tǒng)抗菌素的耐藥性不斷增加。 這不僅可能對生態(tài)環(huán)境造成威脅，也可能沿著食物鏈對人體健康產(chǎn)生威脅。因此，需加強(qiáng)對環(huán)境水體中殘留沙星類化合物及其質(zhì)量濃度的監(jiān)督檢測。

目前，對沙星類化合物的主要檢測方法包括：免疫分析法[4-5]、 毛細(xì)管電泳法[6]、 高效液相色譜法（HPLC）[7]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-10]等。 其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其靈敏度更高、 特異性更強(qiáng)、可更好定量和確證[11]等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。 但環(huán)境樣品一般基質(zhì)較為復(fù)雜，故容易影響檢測并導(dǎo)致儀器污染。此外，樣品中極低濃度的喹諾酮類藥物對檢測靈敏度要求也更高。因此，選擇合適的前處理方法尤為重要，固相萃取前處理技術(shù)因所用的溶劑量少且富集效果好[12-13]，與高效液相色譜質(zhì)譜法搭配較為簡單且靈敏度更高受到廣泛應(yīng)用[14]。 通過采用固相萃取—高效液相色譜質(zhì)譜法并重點(diǎn)優(yōu)化固相萃取條件，為環(huán)境水體中沙星類化合物的檢測分析提供優(yōu)化依據(jù)。

1 試驗(yàn)過程

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：液相色譜質(zhì)譜儀（LC-3000 (Thermo ultimate)-Q trap 5500 (AB)） 配Kinetex R 2.6 μm F5 100（50 mm×3.0 mm）色譜柱（W-SPE12 手動固相萃取裝置(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)）；QSC-12T 氮吹儀 (上海精密儀器儀表有限公司)；25，50，100 μL 微量進(jìn)樣針(hamilton)； 超聲波清洗機(jī)；pH 計(jì)；電子分析天平；藥用一次性注射器(1 mL)；SCAA-114 0.22 μm 針式濾器；C18 固相萃取柱（0.5 g/3 mL）、硅膠固相萃取柱(1.0 g/3 mL，自填)、C3N4固相萃取柱(0.3 g/3 mL，C3N4材料：在溫度為550 ℃條件下煅燒三聚氰胺2 h 后研磨得到C3N4)，Poly-sery HLB 固相萃取柱（規(guī)格為0.5 g/3 mL）。

主要藥品和試劑：甲醇(TEDIA，色譜純)，乙腈（TEDIA，色譜純），鹽酸，氨水，EDTA（乙二胺四乙酸，分析純），超純水，甲酸，三聚氰胺(分析純)；18 種沙星類化合物標(biāo)準(zhǔn)品 （質(zhì)量濃度為100 μg/mL）：西咪替?。–IM）、雷尼替?。≧N）、環(huán)丙沙星（CIP）、克林沙星（CLX）、恩諾沙星（ENO）、氟甲喹（UB）、洛美沙星（LOM）、諾氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFL）、沙拉沙星（SAR）、惡喹酸（OA）、培氟沙星（PEF）、依諾沙星（ENO）、萘啶酸（NA）、西諾沙星（CINX）、二氟沙星（DFX）、奧比沙星（ORB）、司帕沙星（SPA）（購自A ChemTek Inc）。

1.2 樣品預(yù)處理

量取50 mL 樣品并用氨水調(diào)節(jié)pH 值為10，在水樣中加入27.2 mg 的EDTA 后超聲混合溶解。

樣品加標(biāo)： 向上述處理后的樣品中加入一定濃度的沙星類化合物的混合標(biāo)樣。

1.3 固相萃取步驟

先用3 mL 甲醇活化SPE 小柱，再加入3 mL pH值為7 的純水進(jìn)行平衡后進(jìn)行上樣，上樣結(jié)束后用洗耳球?qū)PE 小柱吹干，再用3 mL（V（甲醇）∶V（乙腈）=1 ∶1）進(jìn)行洗脫，將洗脫下來的液體于40 ℃氮?dú)庀麓蹈珊笥?00 μL 溶劑（V(甲醇）∶V（純水）=2 ∶8）進(jìn)行復(fù)溶，定容至500 μL，用1 mL 一次性注射器吸取溶液,經(jīng)過0.22 μm 針式濾器過濾，供LC-MS/MS 分析測試。

1.4 液相色譜條件

流動相：A 為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸乙腈溶液，B 為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液，流速為0.4 mL/min；梯度洗脫：0～1 min，體積分?jǐn)?shù)為3%B；1～11 min，體積分?jǐn)?shù)為3%～75%B；11 ～21 min，體積分?jǐn)?shù)為75%～95%B；21～25 min，體積分?jǐn)?shù)為95%～3%B；25～28 min，體積分?jǐn)?shù)為3%B；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.5 質(zhì)譜分析條件

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源(ESI)，正離子模式離子噴霧電壓(IS)為5 500 V，輔助氣壓力(GS2)為413 kPa，霧化器壓力(GS1)為345 kPa，霧化溫度(TEM)為500 ℃，射入電壓(EP)為10 V，氣簾氣(CUR)壓力為207 kPa。

2 結(jié)果討論與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化和工作曲線

采用ESI 離子源模式、正離子分析條件對18 種沙星類化合物進(jìn)行分析，分析結(jié)果見表1。 18 種沙星類化合物定量離子流色譜圖像見圖1。 標(biāo)準(zhǔn)曲線用質(zhì)量濃度分別為2.5，5.0，10.0，15.0，20.0 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，結(jié)果見表2。

表1 18 種目標(biāo)沙星類化合物質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

表2 18 種沙星類化合物工作曲線

圖1 18 種沙星類化合物定量離子流色譜圖像

2.2 樣品提取pH 值條件的優(yōu)化

樣品溶液中的pH 值影響著沙星類化合物的存在形式，即溶液中沙星類化合物的離子狀態(tài)或分子狀態(tài)對固相萃取效率有很大的影響。 有研究[8]表明，沙星類化合物因其特有的羧基，當(dāng)采用萃取方式進(jìn)行樣品前處理和萃取液的pH 值調(diào)至堿性條件時(shí)，沙星類化合物易呈離子態(tài)，可顯著提高沙星類化合物在萃取層溶液中的分配系數(shù)，從而保證較高的回收率。另有研究證明，堿性條件下沙星類化合物的提取效率更高[15]。 綜上所述，實(shí)驗(yàn)前優(yōu)化處理選擇用氨水將樣品pH 值調(diào)節(jié)至10，再進(jìn)行固相萃取。

2.3 不同固相萃取小柱的影響

4 種不同固相萃取柱中3 種為商品化的固相萃取柱，另一種為自行制備的C3N4材料，考慮C3N4具有高吸附性能表面比及其在吸附領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，試驗(yàn)采用C3N4材料為吸附劑。測試結(jié)果見表3。由表3 可知，C18 固相萃取小柱的平均回收率為2.7%～111.2%，相對平均偏差為0.8%～50.0%；硅膠固相萃取小柱平均回收率為0.2%～92.1%，相對平均偏差為0.1%～74.0%；C3N4固相萃取小柱平均回收率為1.0%～122.5%，相對平均偏差為0.2%～14.6%；HLB固相萃取小柱平均回收率為31.9%～134.2%，相對平均偏差為0.8%～46.5%。 綜上所述，HLB 固相小柱對于18 種沙星類化合物，顯示了較好的萃取性能，適合作為批量樣品的檢測研究。 但C3N4則顯示了較好的穩(wěn)定性，其相對平均偏差最小，而且彰顯了對沙星類化合物的選擇吸附功能，部分沙星類化合物在C3N4固相萃取柱上被穩(wěn)定吸附，如依諾沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等在C3N4固相萃取柱上較少出現(xiàn)回收率偏大或偏小的情況。

表3 不同種固相萃取小柱下18 種沙星類化合物的回收率 %

2.4 方法檢出限的計(jì)算

按照1.2 和1.3 節(jié)的方法采用HLB 固相萃取柱進(jìn)行處理，樣品平行測定7 次計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差S，根據(jù)MDL=S×t/v （在99% 置信區(qū)間，t6= 3.143，v = 50 mL）計(jì)算方法檢出限，具體結(jié)果見表4。

表4 18 種沙星類化合物的檢出限 μg·L-1

2.5 實(shí)際水樣測試結(jié)果

按照上述優(yōu)化的方法對4 個實(shí)際飲用水水樣進(jìn)行沙星類化合物的測定，在水樣1 中檢測出質(zhì)量濃度分別為19.19，9.11 和6.05 ng/L 的西咪替?。–IM）、沙拉沙星（SAR）和二氧沙星（DFX），其沙星類化合物總質(zhì)量濃度為34.35 ng/L；在水樣2 中檢測出質(zhì)量濃度為6.73 ng/L 的恩諾沙星（ENR），其沙星類化合物總質(zhì)量濃度為6.73 ng/L；在水樣3 和水樣4 中未檢到18 種沙星類化合物。 由此可見，在飲用水中檢測出18 種沙星類化合物的質(zhì)量濃度為0 ～19.19 ng/L。

3 結(jié)論

（1）基于固相萃取和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立水樣中18 種沙星類化合物的檢測方法。結(jié)果表明，該方法有較好的方法檢出限，為0.005 3～0.078 2 μg/L，加標(biāo)回收率為31.9%～134.2%。

（2）根據(jù)優(yōu)化固相萃取柱的各項(xiàng)條件和實(shí)驗(yàn)的酸度，比較不同固相萃取填料對方法的影響。試驗(yàn)表明，HLB 小柱顯示了較為寬廣的應(yīng)用范圍為31.9%～134.2%，相對平均偏差為0.8%～46.5%，可滿足環(huán)境樣品中18 種抗生素類化合物的痕量檢測要求。同時(shí)對自制的C3N4固相萃取小柱也進(jìn)行了研究，顯示此填料對部分抗生素有更好的穩(wěn)定性，后期將進(jìn)一步開展C3N4在固相萃取方面的應(yīng)用。

（3）該方法準(zhǔn)確、靈敏，可滿足飲用水中多種沙星類化合物的分析需要。 對4 個飲用水源地水樣中沙星類化合物的檢測質(zhì)量濃度為0～19.19 ng/L。