藻菌生物膜對廢水Cu2+吸附及其胞外聚合物變化研究

任蕓蕓，胡文杰，張 莎

(1.銅川職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 銅川 727031；2.橫河電機(jī)（中國）有限公司，陜西 西安 710075；3.陜西科技大學(xué)，陜西 西安 710021)

0 引言

我國工業(yè)發(fā)展迅猛，對于原材料及產(chǎn)品生產(chǎn)能力的需求日益增多，而由此產(chǎn)生的資源開采和后續(xù)產(chǎn)業(yè)排放引起的環(huán)境問題也愈發(fā)嚴(yán)重，其中重金屬污染由于毒性強(qiáng)、存在期長最引人擔(dān)憂[1]。Cu 作為典型的重金屬污染物，由于其使用范圍廣泛，成為了最嚴(yán)重的重金屬污染之一[2]。 雖然微量Cu 是生物體生長發(fā)育的必須元素，但濃度過高時(shí)將會引起生物體代謝紊亂并進(jìn)而形成毒害作用[3]，并通過水流沖刷以及隨水流向下滲透等方式進(jìn)入地球的水循環(huán)，并最終通過生物鏈超量累積于生物體內(nèi)，對生物體造成長期毒害作用[4]。 因此，近年來對Cu 污染水體的有效處理已經(jīng)逐漸引起關(guān)注。

重金屬污染水體的修復(fù)的方法主要有3 類：物理、化學(xué)及生物修復(fù)法。 其中，生物修復(fù)法由于修復(fù)成本低、 環(huán)境友好性強(qiáng)以及無二次污染等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[5]。 CHOI Y S 等[6]研究利用蚯蚓處理含Cu 和Hg 的泥土，結(jié)果表明處理后污泥中的Cu 含量降低了23.86%。 楊世勇等[7]研究發(fā)現(xiàn)高山甘薯可以有效富集Cu，富集量可達(dá)12 300 mg/kg。 李影等[8]研究了蕨類草本植物對Cu 的富集作用，結(jié)果表明節(jié)節(jié)草和蜈蚣草分別具有耐性強(qiáng)和生物量大的優(yōu)點(diǎn)，是Cu 污染修復(fù)的理想植物。 近年來興起的重金屬藻類修復(fù)技術(shù)逐漸被寄予厚望[9-10]，其對比一般植物修復(fù)及微生物修復(fù)技術(shù)，更具有繁殖快、易回收及吸附量大等優(yōu)點(diǎn)。 馬艷等[11]利用藻菌生物膜處理鉛鋅尾礦渣中的重金屬，結(jié)果表明，藻菌生物膜可以通過胞外聚合物 （EPS） 與重金屬的絡(luò)合來吸附重金屬，其中對Pb2+的吸附能力最強(qiáng)。目前的研究已證明了藻類及藻菌生物膜對部分重金屬具有良好的去除效果。研究擬利用城市自然水體，通過富集培養(yǎng)及掛膜制備藻菌生物膜，并對含Cu2+模擬廢水進(jìn)行處理，以驗(yàn)證藻菌生物膜對Cu2+的吸附效果及其胞外聚合物的變化，可為Cu 污染水體的生物修復(fù)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藻菌富集培養(yǎng)及掛膜所使用原始水樣取自西安市長樂公園芙蓉湖。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

過高濃度的重金屬將對微生物產(chǎn)生脅迫毒害作用，因此在研究中一般設(shè)計(jì)ρ（Cu2+）為0.5～30 mg/L[12-13]。 各因素對Cu2+吸附影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)置如下：

（1）pH 值

模擬廢水ρ（Cu2+）為1 mg/L，室溫，pH 值分別為：3，4，5，6，7，8，9，共7 個(gè)梯度，處理第2 天取樣檢測Cu2+濃度；

（2）溫度

模擬廢水ρ （Cu2+） 為1 mg/L，溫度分別為：25，30，35，40，45 ℃，共5 個(gè)梯度，處理第2 天取樣檢測Cu2+濃度；

（3）初始濃度

模擬廢水ρ（Cu2+）初始分別為1，5，10，15，20 mg/L，共5 個(gè)梯度，室溫，處理第3 天取樣檢測Cu2+濃度、多聚糖及ATP 含量；

（4）吸附時(shí)間

模擬廢水ρ（Cu2+）為1mg/L，室溫，在運(yùn)行前取樣，并在之后每隔1 d 取樣檢測Cu2+濃度、多聚糖及ATP 含量。 并設(shè)置ρ（Cu2+）=0 mg/L 為空白對照組。

上述實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)組；

（5）連續(xù)吸附實(shí)驗(yàn)

模擬廢水ρ（Cu2+）為16 mg/L，反應(yīng)器有效容積為16 L，其中含有6 串掛好膜的填料，利用蠕動泵連續(xù)進(jìn)水及出水，流速為50 mL/h，室溫，每隔1 d 取樣檢測Cu2+濃度，實(shí)驗(yàn)裝置見圖1。

圖1 含Cu2+廢水連續(xù)處理裝置示意

1.3 實(shí)驗(yàn)流程

（1）藻菌富集培養(yǎng)及掛膜

取回一定量水樣后，在容積為20 L 的有機(jī)玻璃圓桶中進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)條件為：自然光照下室溫（夏季）培養(yǎng)，用空壓機(jī)進(jìn)行曝氣，同時(shí)加入16 L 滅菌后的液體培養(yǎng)基供培養(yǎng)生物膜用（培養(yǎng)基成分：每升培養(yǎng)基包含滅菌米湯水100 mL，Ca(NO3)2·4H2O 0.25 g；NaCl 0.3 g； MgSO4·7H2O 0.05 g；KH2PO40.05 g；ZnSO4·7H2O 0.05 g；NaHCO30.02 g；FeCL3，MnCl2，Na2MoO·H2O，CuSO4·5H2O 痕量），之后每10 d 加1次培養(yǎng)基至原水位線。 培養(yǎng)1 個(gè)月后用半軟性填料掛膜15 d，得到藻菌生物膜備用。

（2）藻類鑒別

用壓滴法[14]制作藻類的標(biāo)本片，通過顯微鏡（CX41RF，奧林帕斯有限公司）放大1 000 倍觀察。為便于采集生物膜樣品，每片填料上平行懸置2 片載玻片。 載玻片使用前經(jīng)洗滌劑浸泡24 h 后用去離子水清洗再放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的硝酸溶液中浸泡24 h，重復(fù)2 次后用去離子水洗凈。

（3）Cu2+濃度設(shè)置

使用CuSO4·5H2O（分析純）配置質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的濃縮液，然后在500 mL 培養(yǎng)所得菌液中加入相應(yīng)量的濃縮液得到不同初始濃度的溶液。使用NaOH（分析純）和HCl（分析純）調(diào)節(jié)pH 值，采用pH 計(jì)（PHS-3C,北京普析通用儀器有限公司）測定pH 值，使用水浴加熱鍋調(diào)節(jié)運(yùn)行溫度。 開始運(yùn)行時(shí)各處理組加入1 片掛好膜且長勢相似的藻菌生物膜；

（4）Cu2+濃度及胞外聚合物含量測定

從反應(yīng)器中取100 mL 水樣，用鑷子刮取載玻片上約2 cm3生物膜，一同放入離心機(jī)中在6 000 r/min轉(zhuǎn)速，20 ℃條件下離心10 min，取上清液測水樣中Cu2+濃度，并將離心后的生物膜分成2 份，分別稱量重量并測定生物膜中多聚糖和ATP 含量。

1.4 檢測方法

（1）Cu2+濃度測定采用火焰法[15]。取100 mL 水樣放入150 mL 錐形燒杯中，加入硝酸5 mL，在電熱板上加熱消解（不要沸騰），蒸至10 mL 左右，再加入5 mL HNO3，2 mL HClO4，繼續(xù)消解至1 mL 左右，取下冷卻，并加水稀釋至100 mL，過濾后用原子吸收光譜儀（AnaLyst 800，Perkin ELmer）測定其濃度。 同時(shí)做空白樣；

（2）多聚糖的測定采用苯酚-硫酸法測定[16]。 將離心后的1 份生物膜放入10 mL 試管中加入1 mL去離子水并充分混合，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1 mL，搖勻后迅速加入5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的H2SO4在黑暗環(huán)境中反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后，再震蕩10 s，最后將試管置于30 ℃水浴中10 min 后，使用紫外分光光度計(jì)（Tu-1901，肇慶市高能達(dá)化工有限公司）在490 nm 處比色測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)曲得出多聚糖濃度；

（3）ATP 的測定采用間接測定法[17]。 將離心后的1 份生物膜加入裝有1 mL 去離子水的試管中，完全混合后加入2.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的H2SO4，然后用紗布蓋上、封嚴(yán)，置于溫度128 ℃高壓鍋加壓15 min 后取出，室溫下冷卻后，加1～2 滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液，搖勻，用2 mL 去離子水稀釋，然后再給各管加定磷試劑3 mL，置于45 ℃水浴25 min，取出冷卻至室溫，在紫外分光光度計(jì)660 nm 處比色測定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出ATP 濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用DPS 7.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；Origin Pro 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻菌生物膜的培養(yǎng)及鑒別

藻菌微生物的富集過程及后續(xù)掛膜過程見圖2。

圖2 藻菌生物膜圖像

由圖2（a）可以看出，藻菌微生物在富集30 d 后培養(yǎng)液顏色明顯加深，說明微生物富集濃度顯著提升，并通過軟性填料成功掛膜，得到長勢良好的藻菌微生物掛膜片。由圖2（b）可以看出，通過1 000 倍放大顯微鏡對培養(yǎng)液中的微生物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)此類微生物細(xì)胞呈現(xiàn)為橢圓形或球形，顏色表現(xiàn)為淡綠色，整體為無一定數(shù)目的群體或單細(xì)胞。 與《微生物的鑒別與圖譜》 進(jìn)行對比確認(rèn)此類微生物符合綠藻門小球藻屬微生物的典型特征。

2.2 不同處理參數(shù)對生物膜處理含Cu2+廢水效果的影響

不同處理參數(shù)下藻菌微生物對含Cu2+模擬廢水的處理效果見圖3。

圖3 各處理參數(shù)對生物膜處理含Cu2+廢水效果的影響

由圖3（a）可以看出，在Cu2+初始濃度為1 mg/L、溫度為35 ℃條件下處理1 d，藻菌微生物對Cu2+的吸附效率隨pH 值增加先升高后降低，在pH 值為5時(shí)達(dá)到最佳，吸附量為0.183 7 mg，去除率為36.73%，后續(xù)逐漸降低。 整體而言，酸性環(huán)境下的處理效果優(yōu)于堿性條件；

由圖3（b）可以看出，pH 值為7，微生物在35 ℃時(shí)具有最佳的處理效果，Cu2+吸附量為0.175 0 mg，去除率為34.99%； 當(dāng)溫度超過40 ℃后，微生物對Cu2+的吸附效率較低溫時(shí)明顯下降；

由圖3（c）可以看出，當(dāng)初始質(zhì)量濃度不超過15 mg/L 時(shí)，微生物對Cu2+的吸附效率隨初始質(zhì)量濃度的升高而升高，在15 mg/L 時(shí)，吸附量達(dá)到最高，為2.565 8 mg；但當(dāng)質(zhì)量濃度超過15 mg/L 時(shí)，吸附效率明顯下降；

由圖3（d）可以看出，吸附效果隨時(shí)間增加而升高，處理1 d 時(shí)Cu2+吸附最快，Cu2+濃度明顯降低，Cu2+吸附量和去除率分別為2.303 mg 和57.59%，之后吸附量增速減緩，6 d 后分別為2.877 2 mg 和71.93%，此時(shí)模擬廢液中ρ（Cu2+）為0.280 7 mg/L。

2.3 生物膜處理含Cu2+廢水的動力學(xué)及擬合

對含Cu2+廢水的動態(tài)處理過程進(jìn)行動力學(xué)擬合，所采用的動力學(xué)模型方程及擬合參數(shù)見表1，擬合結(jié)果見圖4。 一級動力學(xué)模型和二級動力學(xué)模型都能較好的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，表明藻菌微生物膜可在3 d內(nèi)較高效的處理含Cu2+廢水。

表1 生物膜處理含Cu2+廢水動力學(xué)擬合及參數(shù)

圖4 生物膜處理含Cu2+廢水的動力學(xué)擬合

2.4 含Cu2+廢水對生物膜胞外聚合物的影響

處理含Cu2+廢水的過程中，藻菌生物膜的胞外聚合物的變化見圖5。

圖5 藻菌生物膜的胞外聚合物的變化

由圖5（a）可以看出，含Cu2+廢水中的藻菌生物膜所具有的多聚糖含量相較空白水樣明顯增加，且隨著處理時(shí)間增加，前者升高的幅度明顯大于后者，在含Cu2+廢水中處理至第4 天時(shí)，藻菌生物膜多聚糖含量達(dá)到最高，為1.915 mg/（mL·g），之后有所下降。

由圖5（b）可以看出，藻菌微生物ATP 含量變化與多聚糖有所不同，含Cu2+廢水中的藻菌微生物ATP 含量明顯低于空白水樣中。 且與空白水樣中ATP 含量持續(xù)上升不同的是，含Cu2+廢水中的藻菌微生物ATP 先降后升再下降，并在第4 天達(dá)到最高，為7.02 mg/（mL·g）。

由圖5（c）可以看出，Cu2+初始濃度的增加將導(dǎo)致藻菌微生物多聚糖和ATP 含量持續(xù)下降。 分別由ρ（Cu2+）為1 mg/L 時(shí)的1.632 mg/（mL·g）和5.21 mg/（mL·g），下降至ρ（Cu2+）為20 mg/L 時(shí)的1.029 mg/（mL·g）和1.75 mg/（mL·g）。

綜上所述，藻菌生物膜的胞外聚合物含量隨處理時(shí)間增加而整體呈現(xiàn)升高的趨勢，但隨著Cu2+初始濃度的增加而表現(xiàn)出下降的趨勢。

2.5 連續(xù)吸附含Cu2+廢水試驗(yàn)

藻菌生物對含Cu2+廢水進(jìn)行連續(xù)吸附處理的出水效果見圖6。

圖6 連續(xù)吸附處理過程中出水Cu2+濃度變化

由圖6 可以看出，在前10 d 內(nèi)，出水Cu2+濃度受培養(yǎng)液稀釋明顯，出水濃度上升明顯且波動較大，出水質(zhì)量濃度從第1 天的0.205 mg/L 逐漸上升至第9 天的0.561 mg/L。 處理20 d 后，液體置換過程幾乎完成，稀釋效果降低，出水Cu2+濃度上升變緩慢且更穩(wěn)定，ρ（Cu2+）從第20 天的0.523 mg/L 逐漸上升至第42 天的0.689 mg/L，并維持在該水平，此時(shí)Cu2+去除率約為95%。

3 討論

微生物對重金屬的去除效果受處理?xiàng)l件及參數(shù)的影響十分明顯，處理參數(shù)及條件不僅影響微生物自身的代謝過程[18]，也影響著微生物重金屬與重金屬的結(jié)合過程[19]。 已經(jīng)有研究證明，藻類對于重金屬的吸附依賴于其細(xì)胞表面的自由位點(diǎn)數(shù)目，而自由位點(diǎn)數(shù)目受pH 值影響明顯[20]。 當(dāng)pH 值為5 時(shí)，藻菌微生物對Cu2+的去除率達(dá)到最高，當(dāng)pH 值＞8時(shí)，其去除率迅速下降。 這是由于在低pH 值的情況下，pH 值的上升會引起細(xì)胞壁上的胺基、 ?；泛土u基等表面官能團(tuán)質(zhì)子化減少，溶液中正電荷與Cu2+的競爭減弱，吸附量得以提升。但較高pH 值下，溶液中的金屬離子又多以氫氧化物的形式存在，剩余Cu2+由于具有較強(qiáng)的電子結(jié)合能力而容易被周圍陰離子包圍，形成帶負(fù)電的基團(tuán)，從而顯著降低藻類對水中銅離子的去除效果；另一方面，過高或過低的pH 值對微生物自身代謝的不利影響也決定了其不佳的吸附性能[21]。

微生物對環(huán)境溫度較為敏感，合適的溫度有利于其自身的代謝過程，并進(jìn)一步影響其對重金屬的吸附[22]。 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，藻菌生物膜處理含Cu2+廢水的最佳溫度為30～40 ℃，在此溫度區(qū)間內(nèi)，微生物可以維持較高的活性，有利于吸附的進(jìn)行。 一方面，當(dāng)溫度過高，微生物體內(nèi)代謝物質(zhì)發(fā)生不可逆的損傷，因此使其吸附Cu2+能力降低；另一方面，Cu2+在生物膜表面的吸附屬于放熱反應(yīng)[23]，這也是溫度升高，吸附量增加的原因之一。 但整體來看，微生物代謝對溫度的敏感性才是影響其重金屬吸附的主要因素。

藻菌生物膜對Cu2+的吸附量及去除率與溶液初始Cu2+濃度強(qiáng)烈相關(guān)。 在多數(shù)以微生物作為吸附劑的研究中[24]，都表現(xiàn)為隨著溶液初始重金屬濃度升高，吸附量先升高后下降，而去除率則持續(xù)下降。 這是由于在微生物對重金屬的容忍范圍內(nèi)，重金屬的濃度增加將提升結(jié)合位點(diǎn)吸附重金屬的概率。 但當(dāng)初始初始濃度超過微生物的容忍范圍，微生物受到強(qiáng)烈的毒害作用而消亡，而作為抗脅迫作用而分泌的胞外聚合物也將急劇減少[25]。 同時(shí)，DLVO 理論[26]也提出，在合適的重金屬濃度范圍內(nèi)，絮凝能力也會隨離子強(qiáng)度的增加而加強(qiáng)，有利于重金屬吸附，而在過高的濃度下則會產(chǎn)生重金屬抗凝作用，減弱重金屬的吸附。

對藻菌生物膜處理含Cu2+廢水不同時(shí)間的研究表明了生物膜在24 h 內(nèi)即可快速吸附Cu2+，并在后續(xù)6 d 內(nèi)繼續(xù)緩慢吸附。 同時(shí)，生物膜在Cu2+脅迫下得響應(yīng)機(jī)制也可以從其胞外聚合物的變化趨勢中觀察到。 與無脅迫下對比發(fā)現(xiàn)，Cu2+脅迫下得生物膜多聚糖含量明顯較高，而ATP 含量則明顯較低，且脅迫下得多聚糖和ATP 含量都在4 d 內(nèi)上升到最高點(diǎn)，后續(xù)緩慢下降。 這說明了Cu2+脅迫下，藻菌生物膜的受重金屬毒性而生理活性較低，ATP 含量減少，此時(shí)，生物膜啟動自身響應(yīng)機(jī)制，分泌更多的多聚糖來抵抗重金屬的毒性脅迫。 后續(xù)隨著生物膜自身響應(yīng)抵抗脅迫過程的進(jìn)行，4 d 后ATP 含量逐漸回歸正常水平范圍，多聚糖的分泌活動也由頂峰逐漸減弱。有諸多研究已經(jīng)證明，大多數(shù)植物及微生物都具有類似的協(xié)調(diào)響應(yīng)抗脅迫機(jī)制來應(yīng)對生存環(huán)境中的不利因素[27]。

4 結(jié)論

生物修復(fù)法由于其成本低廉、 環(huán)境友好性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已成為當(dāng)下重金屬處理領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 本研究探究了通過城市湖水中藻類富集掛膜得到藻菌生物膜對含銅廢水的處理效果，發(fā)現(xiàn)在溫度為35 ℃，pH 值為5 時(shí)生物膜對含Cu2+廢水處理效果最佳，生物膜最大Cu2+耐受質(zhì)量濃度為15 mg/L，并在24 h 時(shí)可近似達(dá)到吸附平衡。 探究了生物膜連續(xù)處理含Cu2+廢水，發(fā)現(xiàn)其具有良好的穩(wěn)定性，處理50 d 時(shí)對Cu2+的去除率仍可達(dá)95%，，藻菌生物膜在含銅廢水處理中具有良好的應(yīng)用前景。