木犀草素通過(guò)CTGF/EGFR通路對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo增殖和凋亡的影響

鐘軒， 王紅鈺， 高建超， 趙金來(lái)， 張?jiān)t然

(1.唐山中心醫(yī)院胃腸外科，河北省唐山市 063000；2.唐山市工人醫(yī)院腫瘤外科，河北省唐山市 063000)

結(jié)腸癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤。手術(shù)切除是治療結(jié)腸癌的首選方法，但僅適用于結(jié)腸癌早期和中期的根治性切除病灶或局灶性病變，但50%的新診斷患者最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病，應(yīng)考慮姑息治療[1]?；瘜W(xué)療法對(duì)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤顯示出一定的作用，然而，化療藥物對(duì)正常組織和細(xì)胞具有一定的毒性[2]。因此，迫切需要找到具有低毒性、高選擇性殺傷癌細(xì)胞的新型天然化合物。木犀草素是一種存在于半枝蓮、金銀花、菊花等傳統(tǒng)中藥中的天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫等作用，能夠抑制乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3-4]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)是細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)合成等生物學(xué)功能調(diào)節(jié)劑，也被確定為促血管生成的輔助因子[5]。本研究探討木犀草素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo增殖和凋亡的影響及其潛在機(jī)制，為木犀草素治療結(jié)腸癌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

木犀草素(西安飛達(dá)生物有限公司)；西妥昔單抗(德國(guó)默克公司)；人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(上海源培生物有限公司)；四噻唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Amresco公司)；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒和RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；CTGF、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、磷酸化EGFR(phosphorylation EGFR，p-EGFR)、蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein serine threonine kinase，Akt)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)、β-actin和辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗IgG(美國(guó)Santa Cruz公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Revco公司)；Sunrise型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；BD FACSCanto型流式細(xì)胞儀和BD垂直電泳儀(美國(guó)BD公司)；電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

LoVo細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件為37 ℃、5%CO2，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、木犀草素低、中、高劑量組。陰性對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行處理；陽(yáng)性對(duì)照組用40 μg/L的西妥昔單抗干預(yù)LoVo細(xì)胞，木犀草素低、中、高劑量組分別用20、40、80 μg/L木犀草素干預(yù)LoVo細(xì)胞24 h。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將LoVo細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中(200 μL/孔)，用不同質(zhì)量濃度木犀草素(0、10、20、40、80、160 μg/L)共孵育24、36、48 h后加入MTT(50 μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜(200 μL/孔)，振蕩，酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定光密度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。根據(jù)木犀草素確定的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度及作用時(shí)間，用不同質(zhì)量濃度西妥昔單抗(0、5、10、20、40、80 μg/L)共孵育LoVo細(xì)胞24 h后測(cè)定光密度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將LoVo細(xì)胞接種于6孔板中(1×106個(gè)/孔)，按1.2方法干預(yù)細(xì)胞，24 h后收獲細(xì)胞，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用Annexin-V結(jié)合緩沖液重懸并調(diào)整細(xì)胞為1×106個(gè)/mL，分別加入5 μL膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC與5 μL碘化丙啶，充分混勻后室溫避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞CTGF、EGFR、p-EGFR、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白

按1.2收獲細(xì)胞后，PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液100 μL，4 ℃裂解2 h后離心取上清，20 μg/孔進(jìn)行電泳，通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白后用半干印跡儀將其加入硝酸纖維素膜上，將膜與CTGF(1∶400)、EGFR(1∶400)、p-EGFR(1∶200)、Akt(1∶300)、Bcl-2(1∶300)、Bax(1∶500)和Caspase-3(1∶400)進(jìn)行孵育，4 ℃過(guò)夜，PBS洗滌2次，將膜與辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗IgG(1∶10 000)在室溫下孵育30 min，PBS洗滌2次并用ECL試劑盒顯影，采集圖像進(jìn)行分析(以β-actin作為內(nèi)參)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 木犀草素對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響

隨著木犀草素質(zhì)量濃度和作用時(shí)間增加，LoVo細(xì)胞增殖率降低，當(dāng)木犀草素質(zhì)量濃度為40 μg/L時(shí)，作用時(shí)間為24 h時(shí)，增殖率最先降到50%，故選40 μg/L作為半數(shù)抑制質(zhì)量濃度，選24 h作為半數(shù)抑制時(shí)間(表1)。

表1 不同質(zhì)量濃度木犀草素作用不同時(shí)間對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響 單位：%

2.2 木犀草素對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡的影響

與陰性對(duì)照組比較，其余各組細(xì)胞凋亡率均增加(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，各木犀草素劑量組細(xì)胞凋亡率降低，且隨著木犀草素劑量增加呈遞增趨勢(shì)(P<0.05；圖1)。

圖1 木犀草素對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡的影響A為細(xì)胞凋亡圖；B為細(xì)胞凋亡柱狀圖。1為陰性對(duì)照組；2為陽(yáng)性對(duì)照組；3、4、5分別為木犀草素低、中、高劑量組。a為P<0.05，與陰性對(duì)照組比較；b為P<0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較；c為P<0.05，與木犀草素低劑量組比較；d為P<0.05，與木犀草素中劑量組比較。

2.3 木犀草素對(duì)LoVo細(xì)胞CTGF、EGFR、Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的影響

與陰性對(duì)照組比較，其余各組細(xì)胞CTGF、p-EGFR/EGFR、Akt和Bcl-2蛋白水平降低，Bax和Caspase-3蛋白水平增加(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，各木犀草素劑量組細(xì)胞CTGF、p-EGFR/EGFR、Akt和Bcl-2蛋白水平增加，Bax和Caspase-3蛋白水平降低，且隨著木犀草素劑量增加呈劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05；表2和圖2)。

表2 木犀草素對(duì)CTGF、EGFR、Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的影響

圖2 木犀草素對(duì)CTGF、EGFR、Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的影響A為陰性對(duì)照組；B為陽(yáng)性對(duì)照組；C為木犀草素低劑量組；D為木犀草素中劑量組；E為木犀草素高劑量組。

3 討 論

隨著人民生活水平的提高，脂肪攝入增加，而碳水化合物和富含纖維食物的攝入逐漸減少，從而導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)病率增加。既往研究認(rèn)為，人類惡性腫瘤不僅是細(xì)胞增殖失控的疾病，而且是細(xì)胞死亡異常的疾病[6]。體內(nèi)細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡一旦被破壞，就會(huì)發(fā)生腫瘤，而這種不平衡通常是由細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)紊亂引起。腫瘤化學(xué)預(yù)防是指使用無(wú)毒化學(xué)物質(zhì)抑制、延遲或逆轉(zhuǎn)癌變過(guò)程[7]。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，在體外實(shí)驗(yàn)中已被證明具有抗腫瘤活性[8]。本研究結(jié)果顯示，木犀草素抑制LoVo細(xì)胞增殖具有劑量和時(shí)間依賴性。流式細(xì)胞結(jié)果也顯示，木犀草素能誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡。西妥昔單抗是一種嵌合單克隆抗體，是一種用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療的EGFR抑制劑[9]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素對(duì)LoVo細(xì)胞具有一定生物學(xué)作用，雖然沒(méi)有西妥昔單抗強(qiáng)，但考慮到西妥昔單抗不良反應(yīng)較多。因此，還是需要進(jìn)一步研究木犀草素的抗結(jié)腸癌功能的價(jià)值。

CTGF/EGFR通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與細(xì)胞的增殖、黏附、遷移、血管生成及預(yù)后預(yù)測(cè)。CTGF是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，可與其他生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)胞表面蛋白相互作用[10]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β通過(guò)典型的Smad2/3通路激活CTGF表達(dá)，該通路在癌癥發(fā)展中已得到充分研究[11]。在結(jié)腸癌中，CTGF的高表達(dá)與晚期臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。CTGF表達(dá)沉默可顯著降低體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成[13]。EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的膜受體，在人類表皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，EGFR通過(guò)與CTGF結(jié)合磷酸化激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)[14]。EGFR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用是多向的，包括增殖、遷移、細(xì)胞分化和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，與細(xì)胞再生和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。EGFR介導(dǎo)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路，在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞發(fā)育中起關(guān)鍵作用[16]。PI3K/Akt通路在細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程中起著重要的作用，并且在腫瘤細(xì)胞中大多數(shù)PI3K/Akt信號(hào)通路都被激活[17]。研究表明，各種化學(xué)治療藥物通過(guò)阻斷PI3K/Akt通路激活發(fā)揮其抗癌作用。本研究結(jié)果顯示，木犀草素抑制LoVo細(xì)胞中CTGF表達(dá)，從而抑制EGFR的磷酸化，導(dǎo)致Akt表達(dá)降低。

在抗腫瘤治療中，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是其主要的治療策略。凋亡的一個(gè)主要調(diào)控步驟是由Bcl-2蛋白家族的抗凋亡成員和促凋亡成員的比例控制的，這決定了細(xì)胞對(duì)凋亡的易感性[18]。Bax是Bcl-2家族的促凋亡因子，在正常情況下以單體形式位于細(xì)胞質(zhì)中或松散地附著在細(xì)胞膜上。在凋亡信號(hào)刺激后，胞質(zhì)中的Bax易位到線粒體，導(dǎo)致抗凋亡蛋白如Bcl-2及其相關(guān)蛋白控制細(xì)胞色素C(Cyt C)從線粒體的釋放。在細(xì)胞質(zhì)中，Cyt C激活Caspase-3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示，木犀草素抑制LoVo細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax和Caspase-3表達(dá)，從而誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡。

綜上所述，木犀草素通過(guò)抑制CTGF/EGFR通路而抑制LoVo細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡，表明木犀草素可能具有治療和/或輔助治療結(jié)腸癌的作用。