游泳對大腸癌移植瘤小鼠腸道菌群及炎癥的影響

李加鵬，謝秋容，文 穎，陳海春，彭 軍，沈阿靈*

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)體育部，福建福州 350122；

2 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；

3 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建福州 350122；

4 福建師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，福建福州350108

2020 年全球癌癥發(fā)病1 930 萬人，死亡994 萬人，其中大腸癌發(fā)病率為10.0%，居第3 位，病死率為9.4%，居第2 位，其中，大腸癌全球男女性發(fā)病率分別為10.6%和9.4%，病死率分別為9.3%和9.5%［1］，嚴(yán)重危害人類健康。研究發(fā)現(xiàn)，機體一半以上的免疫細胞附著于腸道，腸道菌群通過與腸黏膜免疫系統(tǒng)受體上的各類腸上皮細胞、多核細胞、巨噬細胞和樹突細胞相互作用對免疫系統(tǒng)進行調(diào)控，是機體中免疫調(diào)節(jié)的重要組成部分［2］。

在大腸癌患者體內(nèi)腸道菌群多呈紊亂狀態(tài)，紊亂的腸道菌群可改變腸黏膜滲透性，導(dǎo)致腸道內(nèi)細菌移位和炎癥信號通路的激活，促進腸道慢性炎癥的發(fā)生并大量產(chǎn)生活性氧自由基、氮自由基等，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成DNA 損傷和上皮細胞的增殖，誘發(fā)大腸癌的發(fā)生［3］；另外紊亂的腸道菌群還會對腸道及免疫功能產(chǎn)生影響，繼而參與腫瘤生長的調(diào)控［4］。腸道菌群的檢測已被作為監(jiān)測宿主健康狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，同時也是癌患機體腫瘤預(yù)后評價的重要指標(biāo)之一［5］。

適量的運動作為機體的一種良好外界刺激，部分作用機制源于運動對腸道菌群的調(diào)節(jié)［6］，如可增加有益菌數(shù)量與種類，改變腸道微生物的組成［7］，參與不同疾病的調(diào)控。另外，運動還可通過影響腸道微生物組成，調(diào)節(jié)腸道pH 值，降低大腸癌的患病風(fēng)險［8］。適當(dāng)?shù)捏w育鍛煉對腸道菌群具有正向的調(diào)控作用，有助于維持腸道微生態(tài)平衡，但其中的具體機制仍未得到明確的闡述。據(jù)此，本研究以游泳為干預(yù)手段，基于腸道菌群測序探討游泳對移植瘤小鼠腸道菌群豐度結(jié)構(gòu)及其功能的影響，為運動改善癌患機體腸道菌群參與抑制腫瘤生長的調(diào)控奠定理論與實驗基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF 級BALB/C 雄性小鼠12 只（供應(yīng)商：上海斯萊克實驗動物有限公司），6 周齡，體質(zhì)量（20.4±1.2）g［SCXK（滬）2017-0005］；實驗地點：福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF 級動物房層流架［SYXK（閩）2019-0007］；環(huán)境條件：室溫（24±2）℃，濕度40%～70%，空氣潔凈度7 級，交替進行12 h 光照、12 h 黑暗處理，6 只/籠，正常飲食。實驗動物均嚴(yán)格按照實驗動物福利倫理進行實驗（動物倫理編號：FJTCM IACUC 2019042）。

1.2 主要試劑儀器

實驗用氨水（A512P-500）、甲酸銨（A115-50）、甲酸（A117-50）、LC-MS水（W6-4）、甲醇（A456-4）、LCMS CAN（A955-4），美國Fisher Chemical 公司；色譜儀（UHPLC 3000）、質(zhì)譜儀（Q Exactive），美國Thermo Fisher 公司；色譜柱（PREMIER BEH C18），美國Waters 公司；TNF-α（PT512）、IL-1β（P1301）、IL-10（P1523）ELISA 試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1 CT-26小鼠移植瘤模型的構(gòu)建

取對數(shù)生長期CT-26 細胞懸液（1×107個細胞/mL）與等體積的基質(zhì)膠混勻；采用皮下注射方法將1.0×106個/只（100 μL/只）的基質(zhì)膠混合液注射到小鼠右側(cè)腋皮下5 mm處。在皮下注射2～3 d后，皮下形成明顯且大小相對均一的瘤體即為造模成功。采用瘤體體積計算公式計算瘤體體積，并依據(jù)體積大小，采用隨機分組法將小鼠分為模型組、游泳組，每組6只。

瘤體體積（V）＝?長徑（L）×短徑（S）2

2.2 游泳干預(yù)方案

正式干預(yù)前，移植瘤小鼠經(jīng)過3次（5、15、25 min）遞增時間的適應(yīng)性游泳，適應(yīng)性間隔時間為12 h。正式實驗的游泳運動干預(yù)［7］：采用無負重，游泳時間為30 min/次，2 次/d，早晚8 點各1 次，6 d/周，共計3 周。游泳結(jié)束后迅速用撈網(wǎng)將小鼠撈起，并用吸水紙巾吸去皮毛中水分，吹風(fēng)機暖風(fēng)吹干后放回籠內(nèi)。游泳環(huán)境和條件：水溫（32±2）℃，在長100 cm×寬80 cm×深40 cm 的泳箱內(nèi)進行，游泳干預(yù)時保證每只游泳空間≥200 cm2/只。游泳時，手持玻璃棒對小鼠進行驅(qū)趕，同時防止小鼠擠壓、溺水或靜漂；每次游泳前需對泳箱進行消毒清潔工作，防止小鼠在水中釋放警戒物質(zhì)影響游泳干預(yù)的進行。

2.3 游泳對移植瘤生長的影響

皮下移植瘤造模成功后，進行規(guī)律性游泳干預(yù)，在干預(yù)結(jié)束后，采用異氟烷氣體麻醉小鼠，脫頸致死后剝離瘤體進行拍照，并采用電子天平進行稱質(zhì)量。

2.4 移植瘤小鼠腸道菌群16S rRNA測序

2.4.1 糞便樣品采集保存 在最后一次游泳干預(yù)實驗24 h 后，將小鼠置于高溫高壓后的塑料托盤上，用棉簽取小鼠新鮮糞便3粒，立即置于無菌采樣管中，并迅速經(jīng)液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至實驗室-80 ℃冰箱保存待檢。

2.4.2 DNA 提取及檢測 采用CTAB/SDS 法提取各糞便樣品的總DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳及相應(yīng)儀器確定提取的總DNA 質(zhì)量，按測定的糞便樣品濃度將總DNA 進行稀釋；采用特異引物擴增16S rDNA序列、純化PCR 產(chǎn)物；Illumina HiSeq 平臺測序優(yōu)化；PICRUSt 分析，與數(shù)據(jù)庫中已知細菌比較獲得樣品種屬信息。

2.4.3 腸道菌群的統(tǒng)計分析 通過對腸道菌群的OTU分析、物種注釋及分類學(xué)分析、α多樣性分析、β多樣性分析、樣品熱圖分析、組間差異顯著性分析、KEGG 功能預(yù)測，比較分析2 組樣本的腸道菌群在結(jié)構(gòu)豐度及功能基因的差異。

2.5 ELISA檢測游泳對機體血清炎癥的影響

將TNF-α、IL-1β、IL-10 的ELISA 試劑盒提前置于室溫恢復(fù)，配制相關(guān)的試劑：用純水將20×的濃縮洗滌液稀釋到1×，配制標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液，配置酶結(jié)合物工作液，在作為空白對照的孔中滴加標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)本通用的稀釋液，剩余孔中加入標(biāo)本或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（100 μL/孔），使用封口膜封閉反應(yīng)孔并放入37 ℃的烘箱中進行孵育90 min后，漂洗孔板5次。在空白孔中加入提前20 min配制好的生物素化抗體稀釋液（100 μL/孔），剩余孔中加入生物素化抗體工作液（100 μL/孔）。使用封口膜封閉反應(yīng)孔并放入37 ℃的烘箱中進行孵育60 min 后，漂洗孔板5 次。在空白孔中加入提前20 min配制好的酶結(jié)合物工作液（100 μL/孔），用封口膜封閉反應(yīng)孔并放入37 ℃的烘箱中進行孵育30 min 后，漂洗孔板5 次。每孔加入100 μL 顯色底物并放入37 ℃的烘箱中進行避光孵育15 min后，每孔加入100 μL 終止液并充分混勻后通過酶標(biāo)儀上在459波長處測量OD值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0、GraphPad Prism 7 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)用（）表示。數(shù)據(jù)首先進行方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗，實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，2 組間數(shù)據(jù)的差異通過t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 游泳對小鼠移植瘤生長的影響

游泳干預(yù)結(jié)束后，剝離瘤體進行拍照、稱體質(zhì)量，與模型組相比，游泳組瘤體具有變小的趨勢，見圖1；稱重統(tǒng)計顯示2 組間瘤體質(zhì)量具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 游泳對CT-26移植瘤生長的影響Figure 1 Effect of swimming on growth of transplanted tumor of CT-26

表1 2組瘤體質(zhì)量統(tǒng)計比較Table 1 Statistical comparison of tumor weight between two groups

3.2 Illumina HiSeq 平臺測序質(zhì)量評估——稀釋性曲線

如圖2 所示，2 組樣本的稀釋曲線從0 開始升高趨勢明顯，在測序條目20 000 左右達到平臺期，之后隨著抽取的測序數(shù)據(jù)量的增加，OTU 的數(shù)量增加較為緩慢，表明2 組樣本的測序量和深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種，可進行下一步的數(shù)據(jù)測試和分析。

圖2 2組樣本的稀釋曲線Figure 2 Dilution curves of samples between two groups

3.3 游泳對腸道菌群OTU 聚類的影響

通過繪制韋恩圖（Venn diagram）對所有樣品（相似性＞97%的序列）的OTU 進行分組統(tǒng)計和比較，找出2組樣品中共有的OTU，并且找到只存在于單組樣品中的特有OTU。如圖3 所示，在OTU 水平上，2 組共有487 個重疊細菌種群，模型組特有細菌種群數(shù)目為73 種，游泳組特有種群數(shù)目40 種，表明微生物種群結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了較大的改變。

圖3 2組樣品在OTU水平上的Venn圖Figure 3 Venn diagram of samples at OTU level between two groups

3.4 游泳對腸道菌群α多樣性的影響

對2 組小鼠糞便中的腸道菌群進行α 多樣性分析，結(jié)果如圖4 所示，與模型組比較，游泳組的Ace和Chao1 指數(shù)降低，說明模型組的物種豐富度略高于游泳組；而模型組的Simpson 指數(shù)顯著低于游泳組，同時Shannon 指數(shù)明顯高于游泳組，說明模型組雖然在OTU 數(shù)目上多于游泳組，但是其OTU 在菌群的均勻度上明顯不如游泳組，故綜合微生物群落的豐富度和均勻度揭示，游泳組的腸道菌群生物多樣性要優(yōu)于模型組（P＜0.05）。

圖4 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計Figure 4 Alpha diversity index statistics

3.5 游泳對腸道菌群β多樣性的影響

PCoA 主坐標(biāo)分析用來研究各樣本之間的相似性，在坐標(biāo)圖上樣本距離越遠，差異越大。如圖5所示，在差異貢獻度達到67.92%的主成分PC1 上，模型組和游泳組之間存在明顯的差異與距離（P＜0.05，R＞0），表明2 組的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性較低，存在明顯的結(jié)構(gòu)差異。進一步的降維分析發(fā)現(xiàn)，縱坐標(biāo)β距離數(shù)據(jù)顯示，2組的組間差異明顯大于組內(nèi)差異（R2＝0.657，P＝0.001），說明分組有效，2 組的腸道菌群結(jié)構(gòu)確實存在較大的差異。

圖5 主成分分析Figure 5 PCoA analysis

進一步基于4種不同的距離算法binarry_jaccard、bray_curtis、unweighted_unifrac、weighted_unifrac進行降維處理，得到樣品之間的距離矩陣，通過R語言工具繪制得到代表各樣品間差異的熱圖（圖6），均可說明2組間腸道菌群存在顯著性差異。

圖6 各樣本差異熱圖Figure 6 Heat map of differences among samples

3.6 游泳對腸道菌群在各分類層級上的物種差異及其豐度的影響

為了進一步解析游泳干預(yù)后的腸道群落結(jié)構(gòu)改變及在各分類層級上的差異，對獲得的OTUs 從門、綱、目、科、屬各分類等級進行物種分類，并繪制物種分布柱狀圖（圖7）。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，2組在門的水平上排位前十菌門為：擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋體門（Spirochaetes）、Epsilon‐bacteraeota、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、Patescibacteria、藍藻門（Cyanobac‐teria）、軟壁菌門（Tenericutes）、Deferribactere。通過對排名前十的菌門的相對豐度進行比較發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，游泳組Firmicutes 比例減少了39%（P＜0.05），而Bacteroidetes豐度上調(diào)了44%（P＜0.05），說明規(guī)律性游泳訓(xùn)練降低了腸道菌群F/B（Firmicutes/Bacteroidetes）比值。

在綱水平上進行2組對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，游泳組腸道菌群中的擬桿菌綱（Bacteroidia）占比增加了44%（P＜0.05），而致病菌或條件性致病菌：梭菌綱（Clostridia）、丹毒絲菌綱（Erysipelotrich‐ia）、桿菌綱（Bacilli）的含量分別減少了14%、13%、15%（P＜0.05）。見圖7B。

在目水平上進行2組對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組比較，游泳組的Clostridiales（梭菌目）、Erysipelotrichales（丹毒絲菌目）、Sphingomonadales（鞘脂單胞菌目）和Lactobacillales（乳桿菌目）的豐度分別減少了12%、13%、8%和15%（P＜0.05），而Bacteroidales（擬桿菌目）豐度顯著增加了44%（P＜0.05）。見圖7C。

在科水平上進行2組對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組比較，游泳組普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、Murib‐aculaceae 和毛螺菌科（Lachnospiraceae）的含量分別增多了8%、38%、20%（P＜0.05），而消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、韋榮球菌科（Erysipelotricha‐ceae）、梭菌科（Clostridiaceae_1）和鏈球菌科（Strepto‐coccaceae）豐度分別減少16%、13%、17%和11%（P＜0.05）。見圖7D。

在屬水平上進行2組對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組比較，游泳組中S24-7科細菌屬（Uncultured-bacteri‐um-f-Muribaculaceae）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotel‐la）和毛螺菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group）的豐度分別增加了37%、6%、11%（P＜0.05），而蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）和梭狀芽胞桿菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）分別減少了13%、12%和16%（P＜0.05）。見圖7E。

圖7 腸道菌群在各分類層級上的物種差異及其豐度Figure 7 Species diversity and abundance of intestinal flora at different taxonomic levels

3.7 游泳對組間樣品LEfSe分析的影響

根據(jù)LEfSe 分析（不同組產(chǎn)生顯著性差異影響的微生物群落分析），進一步計算2組中存在顯著性差異菌群的LDA 值，以2 作為分界制作LDA 差異貢獻條形圖（圖8），可以直觀地反映組間存在顯著性差異的微生物類群豐度對差異的貢獻值。如圖所示，厚壁菌門、梭菌科、消化鏈球菌科等29個分類群是游泳組腸道內(nèi)豐度顯著下調(diào)的菌群，而在擬桿菌門、Muribaculaceae門、Alloprevotella、普雷沃氏菌科、氏菌屬等27 個分類群是游泳組腸道內(nèi)豐度顯著上升的菌群，它們是構(gòu)成了2 組產(chǎn)生顯著性差異的主要貢獻菌群。

圖8 LDA值差異貢獻條形圖Figure 8 LDA value difference contribution bar graph

3.8 游泳對腸道菌群KEGG 功能基因在代謝通路中富集的影響

從圖9中可以看出2組19個代謝通路差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組中功能基因代謝通路在傳染病、碳水化合物代謝、寄生、膜轉(zhuǎn)運、外源性生物降解與代謝、藥物依賴、免疫疾病及其他氨基酸代謝通路等方面富集程度顯著高于游泳組（P＜0.05）；游泳組中功能基因代謝通路在免疫系統(tǒng)、運輸和貯藏、其他次生代謝物的生物合成、能量代謝、多糖生物合成和代謝、內(nèi)分泌代謝疾病、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、信號分子的相互作用途徑等方面富集程度顯著高于模型組（P＜0.05）。

圖9 2組小鼠腸道菌群的基因功能富集分析Figure 9 Gene functional enrichment analysis of intestinal microflora in mice between two groups

3.9 游泳對移植瘤小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-10表達水平的影響

部分腸道菌群可通過多途徑、多通路激活宿主NF-κB 信號通路，促使宿主分泌大量的TNF-α、IL-1β 等細胞因子，促進腫瘤細胞的增殖與存活［9］。為了探討游泳改善腸道菌群的潛在作用機制，進一步采用ELISA 檢測移植瘤小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-10 的表達水平。如圖10 所示，移植瘤小鼠在游泳干預(yù)后，游泳組小鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β 含量水平顯著性降低（P＜0.05），免疫因子IL-10 在經(jīng)過游泳干預(yù)后含量水平顯著性提高（P＜0.05），提示游泳可顯著降低CT-26 移植瘤小鼠機體炎癥水平提高免疫力。

圖10 2組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-10含量水平比較Figure 10 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-10 in serum of mice between two groups

4 討論

腸道菌群與機體保持著和諧共生或者相互拮抗的關(guān)系［10］?？赏ㄟ^參與機體消化吸收、神經(jīng)調(diào)控、炎癥免疫等反應(yīng)，起到保護腸道黏膜屏障、改善機體代謝能力、調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)、抗炎等功能［11］。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，大腸癌患者與健康人群腸道中的微生物菌群的組成和分布特征存在極大差異，大腸癌患者腸道中，厚壁菌門及梭桿菌屬的豐度增加。此外，對比癌旁組織與癌變組織，乳球菌和梭桿菌的豐度有所增加［12］。腸道微生物的組成與眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)，腸道菌群也逐漸成為機體生理健康狀況評估以及癌癥發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo)之一。

4.1 運動參與調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)

目前研究發(fā)現(xiàn)，運動對機體產(chǎn)生的抗炎抗腫瘤的作用，部分作用得益于運動可調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，優(yōu)化有益菌群，均衡腸道微生態(tài)，但對其中的具體作用機制研究較少，為了探究運動是否能夠通過改善腸道菌群來抑制腫瘤的生長，本研究以CT-26移植瘤小鼠為模型，通過16S rRNA 測序技術(shù)分別檢測了2 組糞便中的菌群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)游泳組的腸道菌群生物多樣性要優(yōu)于模型組（P＜0.05），說明游泳干預(yù)能夠顯著提高移植瘤小鼠的腸道菌群多樣性。在β 多樣性分析中，PCoA 主坐標(biāo)圖顯示在對差異貢獻最大的主成分PC1 上，2 組的差異值達到了67.92%，說明2 組小鼠腸道菌群存在明顯的群體差異，進一步揭示了游泳干預(yù)對移植瘤小鼠腸道微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)具有重要的影響。

4.2 游泳干預(yù)提升大腸癌移植瘤小鼠菌群多樣性，提高有益菌占比

為了進一步明確游泳干預(yù)是否改善了移植瘤小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，對獲得的OTUs 從門、綱、目、科、屬等各層級進行物種分類，從各個分類層級的物種分布柱狀圖中，可直觀地看出2 組在各個分類等級中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。在門層級上，與移植瘤小鼠模型組相比，游泳組中厚壁菌門的比例顯著減少（P＜0.05），而擬桿菌門豐度顯著提高（P＜0.05）。在急性結(jié)腸炎中，厚壁菌門與擬桿菌門的比值顯著提高，且厚壁菌門的豐度增加以及擬桿菌門的減少都被證明有助于大腸癌的發(fā)展。對大鼠的大腸癌模型進行腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，相較于健康組，大腸癌大鼠腸道中厚壁菌門數(shù)量增加，擬桿菌門豐度減少，變形菌門差異無統(tǒng)計學(xué)意義，普雷沃菌屬、乳酸桿菌屬和密螺旋體屬較健康組少，而梭桿菌在腸癌組樣品中豐度較高［13］。而運動干預(yù)能夠減輕厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度比值升高的情況［14］；不同運動方式的干預(yù)，均可減輕肥胖小鼠腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度失衡的狀態(tài)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)3周有規(guī)律的游泳訓(xùn)練對移植瘤小鼠腸道內(nèi)菌群在門層級上的組成也起到了較好的調(diào)節(jié)作用。

在門層級下，與模型組相比，游泳組中豐度顯著提高的擬桿菌門的細菌種類中，含量顯著提升的是擬桿菌綱和彎曲菌綱，以及其下屬分類層級的彎曲菌目、Muribaculaceae科、Prevotellaceae科、Prevotel‐laceae_UCG_001 屬、擬普雷沃菌屬、氏菌屬等；運動干預(yù)后，整體豐度下調(diào)的厚壁菌門細菌種類中鏈球菌科、消化鏈球菌科、丹毒絲菌科、鏈球菌屬等含量減少，而毛螺菌科、胃瘤菌科和Lachnospiraceae_NK4A136_group 屬的豐度提升。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌大鼠腸道微生物中，普雷沃式菌科和胃瘤菌科的豐度相較于健康大鼠明顯降低，說明這兩類菌群的數(shù)量與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展呈現(xiàn)負相關(guān)的關(guān)系［16］。而Muribaculaceae 是在2019 年被劃分為擬桿菌門下，是一種具有抗炎作用的益生菌［17］。此外，王婷婷［18］在對56 例健康對照和46 例大腸癌患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)分析過程中發(fā)現(xiàn)，一些條件致病菌大量活躍于大腸癌患者的腸道中，主要包括消化鏈球菌科、腸球菌屬、鏈球菌科、志賀氏桿菌屬等細菌；另一方面，在健康對照中能夠產(chǎn)丁酸鹽的毛螺菌科等豐度提高。研究證實，丁酸鹽還能夠降低腸細胞DNA 損傷，促進損傷腸細胞凋亡，提高機體免疫起到抗炎、抗腫瘤的功能，進而降低腸道的炎癥反應(yīng)和患大腸癌的風(fēng)險［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，游泳干預(yù)能夠改善移植瘤小鼠腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)，下調(diào)條件致病菌鏈球菌科、消化鏈球菌科、丹毒絲菌科、鏈球菌屬等的豐度，同時增加丁酸鹽產(chǎn)生菌毛螺菌科、氏菌屬等細菌的數(shù)量，進而延緩大腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

4.3 游泳通過影響腸道菌群功能基因在代謝途徑上的改變，參與大腸癌移植瘤小鼠機體的炎癥免疫調(diào)控

為了進一步探討游泳運動通過改善移植瘤小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)延緩移植瘤生長的機制，通過KEGG 分析對游泳干預(yù)前后的移植瘤小鼠的腸道菌群功能基因在代謝途徑上進行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，游泳組腸道菌群功能基因在免疫系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運和代謝、能量代謝等通路中富集程度顯著高于模型組（P＜0.05）有關(guān)。在本實驗結(jié)果中，干預(yù)后移植瘤小鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β 下降（P＜0.05），而IL-10水平顯著提高（P＜0.05），說明在游泳干預(yù)后，腸道菌群介導(dǎo)的機體免疫對移植瘤小鼠的機體炎癥水平具有一定的抑制作用。

如前所述，腸道致病菌群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物引起的炎癥反應(yīng)是大腸癌發(fā)生的主要因素之一。無論是由潰瘍性結(jié)腸炎惡化導(dǎo)致的炎癥性大腸癌，還是散發(fā)性的大腸癌，其發(fā)生、發(fā)展通常都伴隨著炎癥滲透反應(yīng)和促炎細胞因子TNF-α、IL-1β 等的釋放［20］。如脆弱擬桿菌在小鼠腸道內(nèi)定植后會產(chǎn)生腸毒素，而腸毒素會引起腸組織損傷，進一步激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3，誘導(dǎo)細胞因子白細胞介素-17（in‐terleukin-17，IL-17）的產(chǎn)生，形成結(jié)腸腫瘤［21］。這些研究均證實了腸道菌群的結(jié)構(gòu)在維持機體免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面扮演了重要的角色，一旦出現(xiàn)病原菌入侵或腸道致病菌增加時，腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡被打破，促進腸組織炎癥和損傷，誘發(fā)大腸癌的發(fā)生［22］。

運動作為可以影響腸道菌群的積極因素可調(diào)節(jié)腸道菌群的豐度及結(jié)構(gòu)，提高微生物多樣性，保持腸道微生態(tài)平衡，達到改善機體健康的作用［23］。前期研究發(fā)現(xiàn)，運動能夠提高腸道菌群中負責(zé)分泌短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的微生物的比例，而SCFAs 可經(jīng)人體消化道內(nèi)膜吸收后，可參與調(diào)節(jié)機體內(nèi)分泌，維持機體的能量穩(wěn)態(tài)［24］。其中，丁酸的分泌能夠消除腸道炎癥，平衡腸道微生態(tài)，有助于腸道細胞的生存［25］，有效防治潰瘍性結(jié)腸炎和大腸癌的發(fā)生［26］。

研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律性游泳運動能夠顯著阻斷胰島素抵抗大鼠的氧化應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進一步激活I(lǐng)KK/NF-κB 通路，抑制TNF-α 的轉(zhuǎn)錄表達降低機體炎癥水平［27］。運動亦可通過減少腸道近端和遠端中的環(huán)加氧酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）等炎癥標(biāo)志物，降低機體炎癥水平［28］。譙蔚茜［29］研究發(fā)現(xiàn)，普雷沃菌屬等豐度升高能夠降低炎癥因子COX-2、TNF-α、IL-8 及STAT3 的表達，改善因1，2-二甲基肼誘導(dǎo)大腸癌導(dǎo)致的腸道菌群多樣性和結(jié)構(gòu)的失衡，刺激細菌產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物，進而降低大腸癌發(fā)生的風(fēng)險。

本研究發(fā)現(xiàn)：3 周規(guī)律性游泳訓(xùn)練能夠提高移植瘤小鼠腸道微生物多樣性，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)中擬桿菌門、厚壁菌門、螺旋體門及變形菌門的相對比例，逆轉(zhuǎn)移植瘤小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度失衡的情況，提高腸道內(nèi)SCFAs 產(chǎn)生菌（Ru‐minococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroides 和Pre‐votellaceae 等）的豐度，這些SCFAs 產(chǎn)生菌通常與抗炎因子TGF-β 和IL-10 等以及控制調(diào)節(jié)性T 細胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 的含量成正比，而與促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-17 等以及細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的表達呈負相關(guān)，對減輕機體免疫炎癥反應(yīng)，促進結(jié)腸組織損傷修復(fù)，抑制腸源性內(nèi)毒素的釋放，維持腸道內(nèi)微生態(tài)的平衡，有效防治大腸癌的發(fā)生均具有積極的促進作用。

5 結(jié)論

本研究探討了游泳干預(yù)、腸道菌群和小鼠大腸癌移植瘤生長之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)游泳干預(yù)可能通過改變移植瘤小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)，改善腸道微生態(tài)，增加毛螺菌科等負責(zé)分泌丁酸鹽的菌群豐度，促進能量代謝，增強腸黏膜的免疫屏障功能，降低機體炎癥水平。其中，游泳、腸道菌群與腫瘤生長抑制之間的關(guān)系以及基于游泳運動改變菌群對大腸癌移植瘤生長的具體抑制作用機制的研究還有待進一步深入。