低能氮離子注入誘變大腸桿菌對多粘菌素B的耐藥研究*

蔡長龍，王 婷，唐 朝，錢衛(wèi)東

(1.西安工業(yè)大學 光電工程學院,西安 710021；2.陜西科技大學 食品與生物工程學院,西安 710021)

近年來，隨著抗生素在牲畜養(yǎng)殖和臨床治療中的大量使用，微生物多重耐藥(Multidrug Resistance，MDR)與泛耐藥(Pandrug Resistance，PDR)問題逐年加劇[1-2]。多粘菌素(Polymyxin)是多粘類芽孢桿菌產生的一種多肽類窄譜抗生素，對于治療多重耐藥，特別是碳青霉烯類多重耐藥的革蘭氏陰性細菌感染有較好的效果，被認為是治療大腸桿菌等革蘭氏陰性菌感染的最后防線[3]。但是隨著多粘菌素作為促生長劑在畜牧生產中的推廣應用，我國致病性大腸桿菌中多粘菌素耐藥株及耐藥基因mcr-1檢出率呈爆發(fā)式增長。其中18個省豬糞源大腸桿菌中mcr-1的攜帶率高達45.0%～100%；禽致病性大腸桿菌中mcr-1的檢出率從5.2%增長到30.0%，而30個省和自治區(qū)健康個人樣本中mcr-1的陽性率為3.7%～32.7%,嚴重威脅公共衛(wèi)生和人民健康[4-6]。

自然界中雷電、火山爆發(fā)等過程產生大量低能離子，這些低能離子通過能量沉積、電荷轉移和交換等效應，使得生物體遺傳物質產生突變，促進生物進化[7-8]。本文前期研究發(fā)現低能離子注入介導獲得的31株重組沙漠寡營養(yǎng)細菌(DOB)的全基因組及16S rRNA 基因均發(fā)生了不同程度的突變，其中突變株DOB073中有21個新基因與抗生素抗性相關[9-12]。多重耐藥轉移蛋白(MdtM)可通過外排泵系統(tǒng)將進入胞內的抗菌藥物泵出胞外，從而使菌體內的藥物濃度降低，導致耐藥[13-14]。但低能離子是否能誘變大腸桿菌16S rRNA的序列突變和MdtM基因表達量改變，從而獲得耐藥性，目前尚未有報道。

因此，文中通過不同能量的低能N+注入的方式誘變大腸桿菌ATCC25922獲取變異菌株庫，以抗性平板篩選對多粘菌素耐藥的菌株，采用紙片擴散法和微量肉湯稀釋法測定誘變菌株耐藥表征的變化，并通過PCR和測序分析誘變菌株16S rRNA的序列差異和MdtM基因的表達變化，為探索低能氮離子注入是否參與大腸桿菌多粘菌素耐藥的形成機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌 株

大腸桿菌(Escherichia Coli,E.Coli)ATCC-25922， 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 材料和試劑

FOX30、CTX30、MXF5等抗生素藥敏片(d=6 mm)，Mueller-Hinton Broth(MH)培養(yǎng)基購自OXOID公司；多粘菌素B購自生工生物工程(上海)股份有限公司；細菌gDNA提取試劑盒、 2×Taq Master Mix與瓊脂糖凝膠/PCR產物純化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器和設備

生物改性離子注入裝置，西安工業(yè)大學離子束生物工程及生物多樣研究中心；全波長掃描式多功能讀數儀，美國Thermo Fisher公司；電泳儀和梯度PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大腸桿菌活化及種子培養(yǎng)

將斜面保存的大腸桿菌參考株ATCC25922接種MH肉湯，于37 ℃，160 r·min-1活化培養(yǎng)24 h，取活化菌液劃線接種MHA 平板，于37 ℃培養(yǎng)24 h， 挑取單菌落進行常規(guī)鑒定，鑒定后接種斜面擴大傳代2次，即得大腸桿菌種子。

1.3.2 不同密度大腸桿菌的菌膜制備

取大腸桿菌種子接種MH肉湯，于37 ℃，200 r·min-1，培養(yǎng)至對數生長期，6 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌3 次，用無菌水將菌懸液分別稀釋至1×106，1×107，1×108和1×109CFU·mL-1，隨后分別取100 μL菌懸液涂布于無菌培養(yǎng)平皿(直徑為9.0 cm)中，無菌風吹干形成菌膜。

1.3.3 低能N+注入劑量對大腸桿菌存活率的影響

大腸桿菌的低能N+注入誘變在生物改性離子注入裝置上進行，設置具體參數為：N+離子源注入能量為15 keV，樣本靶室真空度為10-3Pa，N+注入劑量分別為25×1014、50×1014、75×1014、100×1014、125×1014ions·cm-2，每個劑量下設置平行的真空對照。注入完成后，向注入板和真空板分別加入1 mL MH肉湯進行復蘇，取復蘇液以100 μL/板涂布MHA平板，37 ℃培養(yǎng)24～72 h，記錄平板菌落數，計算大腸桿菌存活率。

1.3.4 K-B 法鑒定大腸桿菌耐藥表征

參考CLSI標準判定指南M100(2020版)[15]采用紙片擴散法(K-B法)鑒定大腸桿菌耐藥表征：大腸桿菌接種MH肉湯，于 37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)到對數期，用PBS洗滌，MH肉湯重懸，調整菌液為0.5麥氏標準濁度，取100 μL懸液涂布MHA平板，將藥敏紙片(OXOID)緊貼于MHA平板表面，于 37 ℃倒置培養(yǎng)16～18 h，測定其抑菌圈直徑，根據M100標準判定抑菌表征。

1.3.5 肉湯稀釋法檢測多粘菌素對大腸桿菌MIC

向96孔深孔板中加500 μL 1×106CFU·mL-1的大腸桿菌懸液，加入2倍比稀釋的多粘菌素500 μL/孔，使藥物終濃度分別達到64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25 和0 μg·mL-1，于37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)16～20 h，酶標儀讀取各孔菌液OD600，判定多粘菌素B對大腸桿菌的最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。

1.3.6 低能N+離子誘變及耐藥突變株的篩選

根據1.3.2和1.3.3結果優(yōu)選的菌膜密度和注入劑量對大腸桿菌ATCC2592菌株進行低能N+注入誘變，誘變后菌株涂布MHA平板，37 ℃培養(yǎng)24～72 h，記錄平板菌落數，并通過平板轉印含4×MIC濃度多粘菌素B的MHA平板(MHA-PB+平板)，篩選對多粘菌素B耐藥的大腸桿菌突變菌株，將突變菌株繼續(xù)在MHA-PB+平板傳代3次，以獲得穩(wěn)定傳代的耐藥突變株，并對該菌株的耐藥表征和菌種特征進行鑒定。

1.3.7 耐藥大腸桿菌16S rRNA基因的序列變化

按照 DNA 提取試劑盒提取大腸桿菌DNA做模板，并按照PCR 擴增試劑盒操作指南進行PCR擴增。具體反應體系為：PCR Master Mix(2×) 10 μL，引物各 0.5 μL(引物序列如表1)，模板1 μL 的，補ddH2O 至 20 μL ；PCR 的反應程序：95 ℃ 5 mim→94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，重復30個循環(huán)→72 ℃ 10 min。利用瓊脂糖凝膠電泳分析大腸桿菌中16SrRNA 基因擴增情況，擴增片段大小正確的送上海生工有限公司進行測序，用NCBI-blast對測序結果進行對比分析。

表1 引物序列

1.3.8 耐藥大腸桿菌MdtM基因表達的變化

按照Trizol提取試劑盒提取大腸桿菌總RNA，并立即按照反轉錄試劑盒進行反轉錄，具體程序42 ℃ 15 mim→85 ℃ 5 s，以轉錄得到的cDNA為模板參照1.3.7配置PCR擴增反應體系，進行PCR擴增并利用瓊脂糖凝膠電泳分析大腸桿菌MdtM基因表達的基因表達情況。

1.3.9 數據統(tǒng)計分析

每組實驗均設3 組平行，結果采用平均數±標準差(Mean±SD)表示，用SPSS 20.0軟件和Origin2018進行數據統(tǒng)計分析和圖片繪制。

2 結果和分析

2.1 大腸桿菌的形態(tài)鑒定

將大腸桿菌參考菌株、誘變耐藥菌株，臨床分離耐藥菌株分別劃線接種麥康凱平板，菌落均呈紅色，扁平、邊緣整齊的圓形，且革蘭氏染色為粉紅色短桿菌(直徑為?0.5 μm，長度為1～3 μm)，初步鑒定為大腸桿菌，證明實驗無污染(圖1)。

圖1 大腸桿菌ATCC25922革蘭氏染色鑒定

2.2 不同密度菌膜和不同注入劑量對大腸桿菌存活率的影響

當低能N+注入靶室真空度為10-3Pa，N+離子源注入能量15 keV時，不同密度大腸桿菌菌懸液制備成的菌膜對低能N+注入劑量的敏感性不同。結果如圖2所示，當菌膜密度≤1×107CFU·mL-1時，各個劑量N+注入后，大腸桿菌存活率都較低，甚至無菌落出現；當菌膜密度≥1×108CFU·mL-1時，大腸桿菌的存活率隨著注入劑量增加，呈現先下降后上升再下降又上升的馬鞍形，在注入劑量為100×1014ions·cm-2時，細菌的存活率達到二次高峰，為15.99%，根據低能離子束輻射生物效應的“反常輻照損傷”原理[7-8]，確定后續(xù)低能N+注入誘變的菌膜密度為1×108CFU·mL-1，誘變劑量為100×1014ions·cm-2。

圖2 注入劑量與密度對E.coli存活率影響

2.3 出發(fā)菌株ATCC-25922的耐藥表征

應用K-B法對大腸桿菌的耐藥特征進行檢測，結果出發(fā)菌株ATCC-25922對多數β內酰胺類的阿莫西林/克拉維酸(AMC3)、頭孢西丁(FOX30)和頭孢曲松(CRO5)；對氟喹諾酮類的左氧氟沙星(LEV5)和莫西沙星(MXF5)；對阿奇霉素(AZM15)、慶大霉素(CN30)和多粘菌素B(PB30)等抗生素都敏感(S)，無耐藥(R)現象。微量肉湯稀釋實驗結果證實 ATCC-25922對多粘菌素B敏感，其MIC為6.25 μg·mL-1。

2.4 低能N+注入誘變大腸桿菌耐多粘菌素耐藥株

以15 keV注入能量，100×1014ions·cm-2注入劑量對1×108CFU·mL-1的ATCC-25922進行低能N+注入，結果誘變后得到4976個誘變菌株，存活率為15.95%，通過平板轉印MHA-PB+平板(PB=25 μg·mL-1)，72 h后平板共計長出8個菌落，且傳代3次后仍有3個突變株能在 MHA-PB+平板生長，說明低能N+注入能誘變大腸桿菌獲得多粘菌素B抗性，突變率為0.06%。將其依次命名為25922-PB1、25922-PB2和25922-PB3。

2.5 低能N+注入誘變耐藥菌株的耐藥表征變化

藥物敏感性實驗結見表2，與常用抗生素對出發(fā)菌株ATCC-25922形成的抑菌圈相比較，MXF5、LEV5和PB30對誘變菌株25922-PB1的抑菌圈直徑減少；CRO30和PB30對誘變菌株25922-PB2的抑菌圈直徑減少；CRO5、AMC3、MXF5、AZM15和PB30對誘變菌株25922-PB3的抑菌圈直徑減少。說明誘變菌株25922-PB1，25922-PB2和25922-PB3對于PB由敏感(S)轉為耐藥(R)，并獲得了對其它抗生素的多藥耐藥特性(如圖3所示)。

表2 大腸桿菌耐藥譜

圖3 大腸桿菌抑菌圈直徑

2.6 低能N+注入誘變耐藥菌株的MIC變化

篩選獲得的耐PB菌株25922-PB1、25922-PB2和25922-PB3，對PB的MIC分別增加為100 μg·mL-1、25 μg·mL-1和50 μg·mL-1，其耐藥指數(Resistance Index,RI)分別為16、4和8；說明低能N+注入使參考株ATCC25922獲得了耐PB的特征(圖4)。

圖4 多粘菌素B對大腸桿菌的MIC

2.7 大腸桿菌16S rRNA的擴增和分析

對大腸桿菌分別進行16S rRNA基因擴增，凝膠電泳鑒定，得到大約1600bp擴增片段(圖5(a))。將擴增產物送上海生工生物技術有限公司測序，測序結果用NCBI的Blast分析發(fā)現，耐藥株29522-PB1、PB2和PB3的16S rRNA與參考株ATCC-25922差異性分別為7.2%、0.2%和8.1%，其中耐藥菌株29522-PB1和29522-PB3與ATCC25922差異性較高(圖5(b))。

圖5 大腸桿菌16SrRNA基因擴增結果和同源性分析

2.8 大腸桿菌的MdtM基因的擴增和分析

通過對大腸桿菌分別進行MdtM基因RT-PCR擴增，凝膠電泳鑒定，僅耐藥株29522-PB1擴增得到大約1233bp擴增片段(圖6)，其余菌株均未擴增出MdtM基因片段，說明29522-PB1株可能由于低能N+離子注入導致自身基因或其調控因子基因突變，從而表達量增加，出現肉眼可見擴增條帶。

圖6 大腸桿菌MdtM基因擴增結果

3 結 論

1) 文中通過低能N+注入誘變大腸桿菌 ATCC25922，確定了低能N+注入誘變大腸桿菌的最佳菌膜濃度為1×108CFU·mL-1，最佳注入劑量為100×1014ions·cm-2。以優(yōu)化劑量誘變大腸桿菌ATCC25922，篩選獲得3株耐多粘菌素B的誘變菌株29522-PB1、29522-PB2和29522-PB3，其耐藥指數為4～16倍?；蚍治霰砻髂退幘甑?6S rRNA突變率達到0.2%～8.1%(以ATCC25922為參照)，其中菌株29522-PB1和29522-PB3的突變率較高，且29522-PB1中MdtM基因表達量上調，而MdtM屬于外膜通道蛋白，可增強菌體對多粘菌素B等藥物的外排作用，導致大腸桿菌對藥物耐受性增強。

2) 文中研究結果說明低能N+注入可以引發(fā)大腸桿菌16SrRNA基因的突變和進化，從而引發(fā)其耐藥基因的突變和表達量改變，為探索低能離子注入介導大腸桿菌的耐藥發(fā)生機制提供參考。