響應面法優(yōu)化DHA藻油微膠囊工藝

林榮芳，徐夢豪，高麗偉，趙祥忠*

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；2.山東中碩海洋科技有限公司，山東 日照 276800）

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一種人體必需不飽和脂肪酸，可以顯著促進嬰幼兒智力與視力的發(fā)育，并具有保護視力、消炎、抗衰老、預防心血管疾病等重要作用[1-3]。DHA藻油主要由裂壺藻（Schizochytrium）、吾肯氏壺藻（Ulkenia amoeboida）等藻種代謝產(chǎn)生[4]，具有無重金屬污染、腥味小、易吸收等優(yōu)點，已被廣泛添加到各類嬰幼兒食品、保健品、功能性食品中[5]。DHA藻油由于多不飽和脂肪酸含量較高，加工、存儲條件較為嚴苛，對光、熱、氧氣、金屬等條件敏感，容易發(fā)生氧化酸敗問題，降低DHA藻油功效，食用后損害人體健康[6-7]，極大限制了DHA藻油的應用范圍，因此需要解決DHA藻油易氧化問題。添加各類防腐劑或微膠囊包埋成為提高DHA藻油穩(wěn)定性最重要的兩種方法[8-9]，相比防腐劑的使用，微膠囊化一方面可以掩蓋DHA藻油中的不良風味，另一方面對人體無毒害，此方法能有效提高DHA藻油相關產(chǎn)品的生物利用度。

微膠囊包埋是一種選用特殊材料作為壁材，形成半密閉或密閉空間包埋固、液、氣等物質(zhì)的技術[10-11]，可以有效保留芯材原有營養(yǎng)成分與生物活性，提高芯材穩(wěn)定性，掩蓋芯材不良風味，已廣泛應用于食品、化工、醫(yī)藥等領域。呂軍偉等[12]以大豆分離蛋白和麥芽糊精為壁材對藻油進行微膠囊包埋，最優(yōu)包埋條件下，藻油包埋率可達92.8%，產(chǎn)品具有良好的抗氧化性。袁博[13]的研究表明，以大豆分離蛋白與阿拉伯膠為壁材，微膠囊化后的DHA藻油氧化穩(wěn)定性得到顯著提高。

本研究以DHA藻油為芯材，阿拉伯膠、β-環(huán)糊精復配作為壁材，利用噴霧干燥制備DHA藻油微膠囊，以包埋率為考察指標，采用單因素試驗與響應面優(yōu)化試驗探究最佳DHA藻油微膠囊化的制備工藝，借助熱重分析、掃描電鏡、粒徑分布、傅里葉紅外光譜等檢測方法，分析DHA藻油微膠囊的穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)特征，為DHA藻油的微膠囊工廠化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)與理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DHA藻油：齊魯工業(yè)大學食品學院實驗室；阿拉伯膠（分析純）：天津市北辰方正試劑廠；β-環(huán)糊精（分析純）、Tween-80（化學純）：國藥集團化學試劑有限公司；正己烷（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

XT-03C體式顯微鏡：上海蒲拓光電儀器有限公司；AH-MINI2通用型高壓均質(zhì)機：安拓思納米技術有限公司；ETD-2000離子濺射儀：北京博遠微納科技有限公司；EM-30 Plus臺式掃描電鏡：韓國COXEM公司；TGA-1熱重分析儀：瑞士梅特勒-托利多公司；Mastersizer2000激光粒度儀：馬爾文帕納科公司；YC-015小型噴霧干燥機：上海雅程儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DHA藻油微膠囊制備工藝流程

準確稱取阿拉伯膠、β-環(huán)狀糊精，加入300 mL蒸餾水放置在80℃水浴鍋中進行溶解，3 500 r/min分散均質(zhì)5 min，得到狀態(tài)均勻的壁材；稱取藻油15 g，固定Tween-80添加量為壁材的2%，6 000 r/min分散均質(zhì)5 min；混合壁材與藻油，4 500 r/min分散均質(zhì)5 min得到初乳化液，對初乳化液進行5 min高壓均質(zhì)，間隔10 min，重復操作4次。將均質(zhì)后的乳液立即進行噴霧干燥。

1.3.2 包埋率的測定

參考汪鴻等[14]的方法并稍作改進，準確稱取5 g DHA藻油微膠囊，加入50 mL正己烷進行溶解后過濾，使用50 mL正己烷重復沖洗3次，收集濾液進行旋蒸，測定DHA藻油微膠囊表面含油量。按式（1）計算包埋率。

式中：M為DHA藻油包埋率，%；X為稱取的DHA藻油微膠囊質(zhì)量，g；X1為DHA藻油微膠囊表面含油量，g。

1.3.3 熱重分析（thermogravimetric analyzer，TGA）

取適量DHA藻油微膠囊粉末置于同步熱重分析儀樣品盤中，儀器升溫程序：升溫范圍45℃～800℃，10℃/min，保護氣與反應氣均為N2，保護氣流速20 mL/min，反應氣流速50 mL/min，繪制對應熱重損失趨勢圖。

1.3.4 掃描電鏡分析

將DHA藻油微膠囊粉末均勻涂布于導電膠布，離子濺射儀對DHA藻油微膠囊進行噴金處理，臺式掃描電鏡觀察其表面結(jié)構(gòu)，加速電壓為20 kV，放大倍數(shù)為100倍～5 000倍。

1.3.5 粒徑分析

DHA藻油微膠囊加入去離子水進行溶解，稀釋至合適濃度，用Mastersizer2000激光粒度儀進行粒徑測量。

1.3.6 傅里葉紅外光譜分析

取適量DHA藻油、DHA藻油微膠囊粉末、混合壁材進行紅外光譜檢測，紅外光譜檢測范圍400 cm-1～4 000 cm-1。

1.4 DHA藻油微膠囊制備工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗

1.4.1.1 進風溫度對包埋率的影響

固定進料速度19 r/min，固形物濃度16%，芯壁質(zhì)量比 2∶7，壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比為 1∶2，考察進風溫度（150、155、160、165、170、175 ℃）對 DHA藻油包埋率的影響。

1.4.1.2 進料速度對包埋率的影響

固定進風溫度160℃，固形物濃度16%，芯壁質(zhì)量比 2∶7，壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比為 1∶2，考察進料速度（9、11、13、15、17、19 r/min）對 DHA 藻油包埋率的影響。

1.4.1.3 固形物濃度對包埋率的影響

固定進風溫度160℃，進料速度19 r/min，芯壁質(zhì)量比 2∶7，壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比為 1∶2，考察固形物濃度（10%、13%、16%、19%、22%、25%）對DHA藻油包埋率的影響。

1.4.1.4 芯壁質(zhì)量比對包埋率的影響

固定進風溫度160℃，進料速度19 r/min，固形物濃度 16%，壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比為 1∶2，考察芯壁質(zhì)量比（1∶1、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3、2∶7）對 DHA 藻油包埋率的影響。

1.4.1.5 壁材質(zhì)量比對包埋率的影響

固定進風溫度160℃，進料速度19 r/min，固形物濃度 16%，芯壁質(zhì)量比 2∶7，考察壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比（1∶1、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3、2∶7）對 DHA 藻油包埋率的影響。

1.4.2 響應面設計

在單因素試驗基礎上，選取進風溫度、芯壁質(zhì)量比、進料速度、壁材質(zhì)量比4個因素，利用Design-Expert 10.0根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進行四因素三水平響應面設計，以包埋率為考察指標，優(yōu)化DHA藻油微膠囊工藝條件。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差，采用Origin 8.0軟件進行線性回歸分析及作圖，Design-Expert 10.0軟件進行響應面優(yōu)化試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 進風溫度對包埋率的影響

進風溫度對包埋率的影響見圖1。

圖1 進風溫度對包埋率的影響Fig.1 The influence of inlet air temperature on the mcroencapuslation efficiency

由圖1可知，DHA藻油的包埋率隨進風溫度的升高呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢。較低的進風溫度會降低水分蒸發(fā)速度，乳化液滴表面不能及時形成堅硬的微膠囊外壁，從而導致壁材不能完全包埋藻油滴。同時較高的殘留水分在噴霧干燥過程中極易造成乳化液黏連管壁，降低包埋率與出品率。隨著進風溫度的提高，水分蒸發(fā)加速，微膠囊表面外殼的成形速率提高，包埋率隨之升高，在170℃時DHA藻油的包埋率達到91.27%。但過高的進風溫度會破壞微膠囊外殼的穩(wěn)定狀態(tài)，造成外殼破裂，內(nèi)芯的DHA藻油外滲，隨之包埋率下降。

2.1.2 進料速度對包埋率的影響

進料速度對包埋率的影響見圖2。

圖2 進料速度對包埋率的影響Fig.2 The influence of feed rate on the microencapuslation efficiency

由圖2可知，隨著噴霧干燥器進料速度的增加，DHA藻油包埋率呈先增高后下降的趨勢。進料速度較低的情況下，有利于乳化液的霧化、干燥，但此時較少的物料快速干燥，微膠囊外壁出現(xiàn)干裂，影響DHA藻油的包埋。在進料速度15 r/min時，DHA藻油包埋率最高，達到90.82%，繼續(xù)提高進料速度會造成霧化效果變差，微膠囊無法快速干燥，出現(xiàn)黏壁等問題。

2.1.3 固形物濃度對包埋率的影響

固形物濃度對包埋率的影響見圖3。

圖3 固形物濃度對包埋率的影響Fig.3 The effect of solids concentration on the microencapuslation efficiency

由圖3可知，在探究的固形物濃度范圍內(nèi)，隨著固形物濃度的升高，包埋率先升高后降低。固形物濃度會直接影響乳化液的穩(wěn)定性以及噴霧干燥效果，低固形物濃度的情況下，乳化液黏度小，水分含量高，微膠囊外壁形成速度較慢，不利于DHA藻油的包埋。當固形物濃度升高到16%時，包埋效果最好，包埋率為86.05%。繼續(xù)提升固形物濃度，乳化液的黏度增加會降低乳化效果，不利于噴霧干燥過程中的霧化效果，延長干燥時間，同時造成黏壁現(xiàn)象，無法形成均勻顆粒，降低包埋率及集粉率。

2.1.4 芯壁質(zhì)量比對包埋率的影響

芯壁質(zhì)量比對包埋率的影響見圖4。

圖4 芯壁質(zhì)量比對包埋率的影響Fig.4 The effect of core wall mass ratio on the microencapuslation efficiency

由圖4可知，在探究的芯壁質(zhì)量比范圍內(nèi)，隨著壁材含量的增加，包埋率先升高后下降。壁材質(zhì)量比例較低時，過多的DHA藻油不能被完全包埋，表面油含量較高，包埋率較低。隨著壁材質(zhì)量比例的升高，芯材的包埋率隨之升高，芯壁質(zhì)量比為2∶5時，包埋率達到最高。當壁材含量過高時，過多的阿拉伯膠與β-環(huán)糊精會導致乳化液黏度增大，不利于乳化液的霧化干燥，無法快速形成微膠囊外壁，導致芯材析出包埋率下降。因此，選擇芯壁質(zhì)量比為2∶5最為合適，此時的包埋率為90.23%。

2.1.5 壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比對包埋率的影響

壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比對包埋率的影響見圖5。

圖5 壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比對包埋率的影響Fig.5 The effect of wall material mass ratio（β-cyclodextrin∶acacia）on the microencapuslation efficiency

阿拉伯膠具有黏度低、成膜性好、高乳化性等優(yōu)點，常應用于各種微膠囊的制備[15]；β-環(huán)糊精可以通過分子相互作用力形成穩(wěn)定的中空分子結(jié)構(gòu)，將芯材包裹在內(nèi)部疏水空間中[16]；因此阿拉伯膠同β-環(huán)糊精共同使用能夠有效提高微膠囊粉末的包埋效果。由圖5可知，隨著壁材比中阿拉伯膠比例的增大，DHA藻油微膠囊的包埋率先升高后下降。低濃度的阿拉伯膠無法提供高強度的微膠囊外壁，在干燥過程中，微膠囊外壁因外力作用破裂，導致DHA藻油析出。當β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠質(zhì)量比為1∶3時，DHA藻油的包埋率達到87.67%。繼續(xù)增加阿拉伯膠含量，使得β-環(huán)糊精質(zhì)量分數(shù)下降，微膠囊表面變得松散且孔洞增加，藻油滲出，包埋率下降。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結(jié)果

在單因素試驗基礎上，以DHA藻油包埋率為評價指標，以進風溫度、壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比、進料速度和芯壁質(zhì)量比為考察因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進行四因素三水平響應面試驗，試驗因素水平編碼見表1，試驗方案與結(jié)果見表2。

表1 響應面試驗因素與水平編碼Table 1 Factors and level coding of response surface experiment

表2 響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

利用Design-Expert 10.0軟件對表2進行回歸分析，得回歸方程：R=92.53-2.41A+4.14B-0.90C+5.42D-0.96AB+1.73AC+0.56AD-1.56BC+2.11BD-0.34CD-1.53A2-7.22B2-4.70C2-6.20D2。

方差分析見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

由表3可知，模型P＜0.01，表示該模型回歸極顯著，失擬項P=0.187 7＞0.05，不顯著，該模型擬合性好，使用的二次回歸模型恰當；相關系數(shù)R2=0.978 7，校正決定系數(shù)R2Adj=0.957 4，說明該模型可靠，可用于預測DHA藻油微膠囊制備工藝研究的理論值。由F值可知，各因素對DHA藻油包埋率的影響程度為D（芯壁質(zhì)量比）＞B（壁材質(zhì)量比）＞A（進風溫度）＞C（進料速度）。

2.2.2 各因素間的交互作用

影響DHA藻油微膠囊包埋率的各個因素間的交互作用結(jié)果見圖6～圖11。

圖6 進風溫度與壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比的交互作用Fig.6 Interaction between inlet air temperature and wall material mass ratio（β-cyclodextrin∶acacia）

圖7 進風溫度與進料速度的交互作用Fig.7 Interaction between inlet air temperature and feed rate

圖8 進風溫度與芯壁質(zhì)量比的交互作用Fig.8 Interaction between inlet air temperature and core wall mass ratio

圖9 壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比與進料速度的交互作用Fig.9 Interaction between wall material mass ratio（β-cyclodextrin∶acacia）and feed rate

圖10 壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比與芯壁質(zhì)量比的交互作用Fig.10 Interaction between wall material mass ratio（β-cyclodextrin∶acacia）and core wall mass ratio

圖11 進料速度與芯壁質(zhì)量比的交互作用Fig.11 Interaction between feed rate and core wall mass ratio

由圖6～圖11可知，壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比與芯壁質(zhì)量比的等高線較扁平，交互作用極顯著，進風溫度與進料速度的交互作用和壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比與進料速度的交互作用均較顯著；進風溫度與壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比的交互作用顯示，進風溫度水平的改變，對響應面圖的坡度影響不明顯，壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比水平的改變，其響應面作用影響趨勢變化顯著；進料速度與芯壁質(zhì)量比交互作用趨勢平緩，等高線圖表明兩因素間的作用接近于圓，交互作用最不顯著。

2.2.3 包埋工藝條件確定及驗證

分析響應面法試驗數(shù)據(jù)可知最優(yōu)包埋條件為進風溫度167.15℃，壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比1∶2.82，進料速度15.64 r/min，芯壁質(zhì)量比1∶2.3，最大包埋率95.52%。根據(jù)實際試驗條件，對最佳包埋條件做如下調(diào)整，進風溫度167℃，壁材（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）質(zhì)量比 1∶2.82，進料速度 15.5 r/min，芯壁質(zhì)量比 1∶2.3，在此條件下進行試驗驗證得包埋率為94.87%，試驗值與預測值擬合度較好，說明響應面模型穩(wěn)定可靠。

2.3 熱穩(wěn)定性分析

熱穩(wěn)定分析結(jié)果見圖12。

圖12 DHA藻油微膠囊的熱重分析圖Fig.12 Thermogravimetric analysis diagram of DHA algae oil microcapsules

熱重分析是衡量微膠囊產(chǎn)品耐熱性好壞的重要方法，由于溫度升高，微膠囊發(fā)生物理化學變化引起質(zhì)量損失[17]。由圖12可知，DHA藻油微膠囊從45℃加熱到800℃的過程中質(zhì)量變化分為3個階段，加熱溫度低于165℃，主要為水分的蒸發(fā)，質(zhì)量損失3.77%，說明制備的微膠囊水分含量較低；第二個質(zhì)量損失階段（165℃～350℃），作為復合壁材的阿拉伯膠和β-環(huán)糊精發(fā)生降解，質(zhì)量大幅度減少，損失率為54.67%；繼續(xù)加熱至500℃，微膠囊質(zhì)量損失較小，殷春燕等[18]研究認為此階段質(zhì)量損失是壁材中存在的有機物質(zhì)進一步發(fā)生降解；500℃以后DHA藻油微膠囊熱分解完成，質(zhì)量不再發(fā)生變化。熱穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，加熱低于165℃，DHA藻油微膠囊質(zhì)量變化較小，熱穩(wěn)定性較好，能夠符合大多數(shù)食品加工溫度的要求。

2.4 電鏡分析

電鏡分析結(jié)果見圖13。

圖13 DHA藻油微膠囊掃描電鏡圖Fig.13 Scanning electron microscope image of DHA algae oil microcapsules

由圖13可知，以阿拉伯膠、β-環(huán)糊精復配作為壁材，經(jīng)噴霧干燥制備的DHA藻油微膠囊，尺寸大小相近，且分散性較好，未出現(xiàn)黏連聚集現(xiàn)象。5 000×放大倍數(shù)下，微膠囊呈圓球狀顆粒、整體結(jié)構(gòu)完整，微膠囊外壁未出現(xiàn)破損、孔洞，說明以阿拉伯膠和β-環(huán)糊精復合作為壁材對DHA藻油包埋效果較好，能夠有效阻止DHA藻油與外界不良因素的接觸，延緩氧化。但也有個別微膠囊表面凹陷，呈“話梅狀”，與噴霧干燥過程中水分蒸發(fā)速率不同有關[19]。微膠囊外壁相對光滑，出現(xiàn)點狀突起，分析與制備復合壁材時的均勻性有關，阿拉伯膠出現(xiàn)凝集形成微膠囊表面的突起。

2.5 粒徑分析

DHA藻油微膠囊的粒徑分布越大，分布無規(guī)律，會導致DHA藻油微膠囊溶解度變差，溶解后微膠囊不穩(wěn)定。經(jīng)最佳工藝所得DHA藻油微膠囊粒徑分布如圖14所示。

圖14 DHA藻油微膠囊粒徑分布Fig.14 Particle size distribution of DHA algae oil microcapsules

由圖14可知，DHA藻油微膠囊粒徑分布出現(xiàn)單一峰，粒徑分布比較集中，粒徑分布范圍為7 μm～40 μm，平均粒度為22.384 μm，說明DHA藻油微膠囊有較好的溶解性。

2.6 DHA藻油微膠囊的化學結(jié)構(gòu)分析

DHA藻油和DHA藻油微膠囊紅外光譜圖見圖15。

圖15 DHA藻油和DHA藻油微膠囊紅外光譜圖Fig.15 Infrared spectra of DHA algae oil and DHA algae oil microcapsules

采用傅里葉變換紅外光譜對微膠囊中的DHA藻油與復合壁材分子間的相互作用進行分析，由圖15可知，DHA 藻油在 1 153、1 745、2 854、2 925、3 011 cm-1處形成特征峰，DHA藻油微膠囊在相同特征譜帶處形成吸收峰，說明DHA藻油微膠囊化后，并未改變藻油原有性質(zhì)。微膠囊在 1 153、1 745、2 854、2 925 cm-1處形成的吸收峰明顯減弱，3011cm-1處與C—H拉伸（順勢烯烴—HC CH—）有關的不飽和脂肪酸特征峰消失[20]，說明阿拉伯膠和β-環(huán)糊精作為復合壁材有效覆蓋了DHA藻油特征峰，對DHA藻油的包埋效果較好。

3 結(jié)論

本研究以阿拉伯膠、β-環(huán)糊精為壁材，微膠囊包埋DHA藻油，包埋率為考察指標，單因素試驗結(jié)合響應面試驗優(yōu)化DHA藻油微膠囊化的制備工藝，最佳條件∶噴霧干燥進風溫度167℃，壁材質(zhì)量比（β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠）1∶2.82，噴霧干燥進料速度 15.5 r/min，芯壁質(zhì)量比1∶2.3，固形物濃度為16%，此條件下DHA藻油包埋率為94.87%。微觀檢測表明，DHA藻油被壁材較好的包埋，整體結(jié)構(gòu)完整，外壁無破損、孔洞；DHA藻油微膠囊粉末粒徑分布集中，平均粒徑為22.384 μm，具有良好的溶解性。熱重分析可知，DHA藻油微膠囊在溫度低于165℃熱穩(wěn)定性較好，符合大多數(shù)食品加工溫度的要求。