微波輔助提取獼猴桃果渣總黃酮及其抗氧化活性

李金輝，翁貴英，朱淼，張澤敏，周曉玉，王緒英

（1．六盤(pán)水師范學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州 六盤(pán)水 553004；2．六盤(pán)水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤(pán)水 553004）

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch），又稱(chēng)奇異果，俗稱(chēng)毛桃、陽(yáng)桃、山洋桃、毛梨桃等，為原產(chǎn)于中國(guó)的古老野生藤本果樹(shù)。獼猴桃不但含有豐富的維生素，還含有鈣、鉀、硒、鋅、鍺等微量元素和人體所需17種氨基酸，被譽(yù)為“水果之王”[1]。果渣與鮮果相比，雖然營(yíng)養(yǎng)組分大量流失，但仍然含有較多的蛋白質(zhì)、纖維素、維生素、黃酮類(lèi)化合物和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[2]。黃酮類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的抗氧化性、抗炎抑菌、抗腫瘤、抗輻射、抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防保護(hù)心血管等作用，臨床上可用于治療腦供血不足、腦出血所致后遺癥、高黏脂血癥、腦血栓、冠心病、心絞痛等疾病，且能夠通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)控自噬進(jìn)而干預(yù)炎癥、肝病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等慢性疾病[3-7]。

近年來(lái)有很多關(guān)于沙棘果渣、蘋(píng)果果渣、藍(lán)莓果渣、葡萄果渣、紅棗果渣以及刺梨果渣的研究，但未見(jiàn)獼猴桃釀酒果渣的相關(guān)研究[8-13]。貴州六盤(pán)水的紅心獼猴桃有“神奇美味果，紅色軟黃金”的美譽(yù)，獲得農(nóng)業(yè)部“農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志”認(rèn)證，國(guó)家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)其為“國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”。本研究采用微波輔助技術(shù)提取獼猴桃釀酒發(fā)酵后的果渣中黃酮類(lèi)化合物，采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝條件，并探索獼猴桃果渣總黃酮提取物的抗氧化活性[14-18]，為獼猴桃釀酒果渣“廢物再利用”，開(kāi)發(fā)綠色、安全的天然抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃果渣（釀酒發(fā)酵后的果渣）：六盤(pán)水涼都獼猴桃產(chǎn)業(yè)股份有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸：上海試四赫維化工有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：安徽酷爾生物工程有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉：成都金山化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1901）、純水儀（New Human Power I）：北京普析通用儀器有限公司；常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站（MAS-II型）：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101型）：北京科偉永興儀器有限公司；電子天平（ME104）：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；高速離心機(jī)（TG18K）：長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 獼猴桃果渣總黃酮提取工藝

將獼猴桃果渣于50℃干燥箱中烘至恒重，粉碎后過(guò)60目篩，置于聚乙烯樣袋密封保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱(chēng)取一定量獼猴桃果渣，設(shè)置常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站的微波功率為400 W，以1∶60（g/mL）的料液比加入一定濃度的乙醇溶液，在一定溫度、一定時(shí)間下進(jìn)行提取，提取液在6 000 r/min離心10 min后取上清液，定容至50 mL，得到獼猴桃果渣總黃酮提取液。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用60%乙醇溶液定容至100 mL，得到濃度為100 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取 100 μg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中；分別補(bǔ)充60%的乙醇溶液至5.0 mL；再加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后，加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，再搖勻，放置6 min后，加入4% NaOH溶液4.0 mL，最后用60%乙醇溶液定容，搖勻放置15 min。于510 nm處分別測(cè)定其吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到擬合線性方程：y=0.010 3x-0.000 8（R2=0.999 8）。移取獼猴桃果渣總黃酮提取液1 mL，按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方法步驟操作，根據(jù)下式計(jì)算獼猴桃果渣總黃酮提取率[19]。

式中：C為總黃酮質(zhì)量濃度，μg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；M為獼猴桃果渣質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

將獼猴桃果渣分別按照以下3個(gè)單因素試驗(yàn)進(jìn)行總黃酮的提?。阂掖紳舛?0%、40%、50%、60%、70%、80%，提取溫度60℃，提取時(shí)間15 min；提取溫度30、40、50、60、70、80 ℃，乙醇濃度 50%，提取時(shí)間 15 min；提取時(shí)間 5、10、15、20、25、30 min，提取濃度 50%，提取溫度60℃。以上試驗(yàn)均固定料液比1∶60（g/mL），微波功率400 W。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，選取乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間為自變量，利用Design-Expert8.05b軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of the response surface experiment

1.2.5 抗氧化試驗(yàn)

以DPPH·和ABTS+·清除率為指標(biāo)考察獼猴桃果渣總黃酮的抗氧化活性[20]。

1.2.5.1 DPPH·清除能力測(cè)定

將獼猴桃果渣總黃酮提取物稀釋至不同濃度，每個(gè)濃度的樣品取1mL于比色管中，加入3mL50.0μg/mL的DPPH溶液，充分混合均勻后，在10℃避光條件下反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)下式計(jì)算獼猴桃果渣總黃酮的DPPH·清除率。

式中：As為樣品溶液與DPPH溶液混合液的吸光度；Ac為樣品溶液與無(wú)水乙醇混合液的吸光度；Ab為DPPH溶液與無(wú)水乙醇混合液的吸光度。

1.2.5.2 ABTS+·清除能力測(cè)定

稱(chēng)取ABTS400.0mg，過(guò)硫酸鉀68.8mg，溶于100mL去離子水中，搖勻，10℃避光放置24 h后，作為ABTS母液。取適量ABTS母液，用95%乙醇稀釋至734 nm處吸光度為0.70±0.02，作為ABTS測(cè)定溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。將獼猴桃果渣總黃酮提取物稀釋至不同濃度，每個(gè)濃度的樣品取0.4 mL于比色管中，加入3.6 mL ABTS溶液，充分混合均勻后，在10℃避光條件下反應(yīng)5 min，于734 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)下式計(jì)算獼猴桃果渣總黃酮的ABTS+·清除率。

式中：Ab為ABTS溶液與95%乙醇混合液的吸光度；As為樣品溶液與ABTS溶液混合液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)并繪圖。采用Design-Expert8.05b軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同乙醇濃度對(duì)獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1。續(xù)試驗(yàn)。

圖1 乙醇濃度對(duì)獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from kiwi fruit residues

2.1.2 不同提取溫度對(duì)獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of extraction temperatureon the yield of total flavonoids from kiwi fruit residues

由圖1可知，乙醇濃度小于50%時(shí)，獼猴桃果渣總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大而提高，可能是乙醇濃度的增加有利于黃酮類(lèi)物質(zhì)溶出；當(dāng)乙醇濃度大于50%時(shí)，總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大而降低，可能是溶劑的極性變小，導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)溶出量減少；乙醇濃度為50%時(shí)，獼猴桃果渣總黃酮提取率最高，為2.94%。因此，選擇乙醇濃度為40%、50%、60%進(jìn)行后

由圖2可知，提取溫度小于60℃時(shí)，獼猴桃果渣總黃酮提取率隨提取溫度的升高而提高，可能因?yàn)樘崛囟壬呖杉涌旆肿訑U(kuò)散速率，從而促進(jìn)黃酮類(lèi)物質(zhì)析出；當(dāng)提取溫度大于60℃時(shí)，總黃酮提取率隨提取溫度的升高反而降低，可能是因?yàn)樘崛囟冗^(guò)高會(huì)破壞部分黃酮類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)并促進(jìn)其它非黃酮物質(zhì)析出；提取溫度在60℃時(shí)，獼猴桃果渣總黃酮提取率最高，為2.96%。因此，選擇提取溫度為50、60、70℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the yield of total flavonoids from kiwi fruit residues

由圖3可知，提取時(shí)間小于15 min時(shí)，獼猴桃果渣總黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，這是由于提取時(shí)間短，黃酮類(lèi)化合物未能充分溶出；當(dāng)提取時(shí)間大于15 min時(shí)，總黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)反而降低，這是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溶出的黃酮類(lèi)化合物易分解，導(dǎo)致總黃酮提取率下降；提取時(shí)間為15 min時(shí)，獼猴桃果渣總黃酮提取率最高，為2.93%。因此，選擇提取時(shí)間為10、15、20 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1 回歸模型的建立與分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

通過(guò)Design-Expert8.05b對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析回歸擬合，得到回歸方程為Y=-14.654 75+0.268 25A+0.286 78B+0.187 65C+6.250 00×10-4AB+9.500 00×10-4AC-6.000 00×10-4BC-3.220 00×10-3A2-2.345 00×10-3B2-6.18000×10-3C2。對(duì)擬合方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，該回歸模型P＜0.000 1差異極顯著，失擬項(xiàng)P=0.464 9，沒(méi)有顯著性差異，表明該回歸模型與真實(shí)值擬合度較高。模型中 B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2表現(xiàn)為差異極顯著，A表現(xiàn)為差異顯著，3個(gè)因素對(duì)獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響大小順序?yàn)锽＞C＞A，即提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇濃度。

2.2.2 響應(yīng)面圖與等高線圖分析

各因素交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖4～圖6。

圖4 乙醇濃度和提取溫度交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of the interaction of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of total flavonoids

圖5 乙醇濃度和提取時(shí)間交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of the interaction of ethanol concentration and extraction time on the yield of total flavonoids

圖6 提取溫度與提取時(shí)間交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.6 Effects of the interaction of extraction temperature and extraction time on the yield of total flavonoids

由圖4～圖6可知，AB、AC、BC交互作用的各響應(yīng)面坡度陡峭，等高線均呈橢圓形，說(shuō)明他們之間的交互作用對(duì)獼猴桃果渣總黃酮提取率影響較大，與方差分析結(jié)果一致。

2.3 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

使用Design-Expert8.05b得到獼猴果渣總黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度50.39%、提取溫度65.83℃、提取時(shí)間15.86 min，此條件下總黃酮提取率為3.03%。根據(jù)試驗(yàn)操作的可行性，修正提取工藝條件為乙醇濃度50%、提取溫度66℃、提取時(shí)間16 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到獼猴桃果渣總黃酮平均提取率為3.02%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.33%。

2.4 獼猴桃果渣總黃酮提取物抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除能力

獼猴桃果渣總黃酮提取物和VC的DPPH·清除能力見(jiàn)圖7。

圖7 獼猴桃果渣總黃酮提取物和VC的DPPH·清除能力Fig.7 DPPH·scavenging abilities of total flavonoids from kiwi fruit residues and ascorbic acid

由圖7可知，獼猴桃果渣總黃酮提取物與VC對(duì)DPPH·的清除能力均隨濃度的增大而增強(qiáng)，在濃度小于30.16 μg/mL時(shí)，獼猴桃果渣總黃酮提取物DPPH·清除能力優(yōu)于同濃度VC溶液，在濃度為30.16 μg/mL時(shí)，VC溶液DPPH·清除能力較獼猴桃果渣總黃酮提取物略高。

2.4.2 ABTS+·清除能力

獼猴桃果渣總黃酮提取物和VC的ABTS+·清除能力見(jiàn)圖8。

圖8 獼猴桃果渣總黃酮提取物和VC的ABTS+·清除能力Fig.8 ABTS+·scavenging abilities of total flavonoids from kiwi fruit residues and ascorbic acid

由圖8可知，獼猴桃果渣總黃酮提取物與VC對(duì)ABTS+·的清除能力隨濃度的增大而增強(qiáng)，獼猴桃果渣總黃酮提取物ABTS+·清除能力優(yōu)于同濃度VC溶液，在濃度為12.08 μg/mL時(shí)，獼猴桃果渣總黃酮提取物的ABTS+·清除率為 97.36%，VC溶液ABTS+·清除率為31.71%。獼猴桃果渣總黃酮提取物對(duì)ABTS+·清除能力遠(yuǎn)大于VC溶液。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以獼猴桃釀酒發(fā)酵后的果渣為研究對(duì)象，采用微波輔助法提取總黃酮，在考察乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)單因素基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)獼猴桃果渣總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。獼猴桃果渣總黃酮最佳提取工藝條件為乙醇濃度50%、提取溫度66℃、提取時(shí)間16 min。在此條件下，總黃酮提取率為3.02%。獼猴桃果渣總黃酮提取物對(duì)DPPH·、ABTS+·具有不同程度的清除作用。表明獼猴桃釀酒發(fā)酵后的果渣具有較好的抗氧化活性，可為獼猴桃果渣再利用提供一定的參考依據(jù)。