靈芝醇提物對改善3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的作用

譚孟芳，康信聰，3，4，周佳麗，楊蘭，劉東波，3，4*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，湖南長沙410128；2.國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預技術實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，湖南 長沙 410128；4.植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

胰島素抵抗，即胰島素效應細胞（如脂肪細胞等）對胰島素不敏感[1]，是2型糖尿病、高血壓、肥胖、動脈粥樣硬化等常見代謝綜合征的共同病理[2]。正常生理狀態(tài)下，胰島素能促進脂肪細胞的葡萄糖攝取以及脂肪合成，抑制脂肪分解[3]；當脂肪細胞產(chǎn)生胰島素抵抗，胰島素無法很好地抑制脂肪分解，機體脂解速率上升，血漿中游離脂肪酸水平升高形成高血脂，同時游離脂肪酸異位聚積于其他組織，造成外周組織及全身的胰島素抵抗[4]。

靈芝，真菌擔子菌亞門、層菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬藥用真菌[5]，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品[6]。靈芝在我國有上百年的食用歷史，最新被納入“藥食同源”名單[7]。研究表明，靈芝及其活性成分對糖尿病患者及動物模型有明顯的降血糖、增加胰島素分泌、改善糖耐量、調(diào)節(jié)血脂、延緩糖尿病并發(fā)癥的作用[5]。靈芝醇提物（alcohol extract of Ganoderma lucidum，GLAE）具有減少脂肪細胞脂質(zhì)積累、減少脂肪細胞分化的作用[8]，然而，目前并未有靈芝醇提物改善脂肪細胞胰島素抵抗的研究報道。本研究以地塞米松誘導建立脂肪細胞胰島素抵抗模型，二甲雙胍（metformin，MET）為陽性對照，探究靈芝醇提物對脂肪細胞胰島素抵抗的影響及其分子機制，為靈芝資源的開發(fā)利用提供實驗證據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株

3T3-L1小鼠前脂肪細胞株：中國科學院干細胞庫（編號：scsp-5038）。

1.2 藥物與試劑

赤芝子實體：長沙九峰生物科技有限公司，經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學亞健康干預技術實驗室劉東波教授鑒定為赤芝，藥材符合2020年版《中國藥典》規(guī)定。

二甲雙胍：阿達瑪斯試劑公司；DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）：BI生物公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）、二甲基亞砜：美國西格瑪奧德里奇公司；胰島素（insulin，ins）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）凝膠快速配制試劑盒、兔二抗、鼠二抗、一抗稀釋液、二抗稀釋液：北京碧云天生物技術公司；CCK-8試劑盒：南京諾唯贊生物科技有限公司；葡萄糖氧化酶法測定試劑盒、甘油三酯試劑盒：南京建成生物工程研究所；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（1-methyl-3-isobutylxanthine，IBMX）、油紅“O”試劑盒、30%凝膠儲備液AB液：北京索萊寶生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶、雙抗（pen strep）：美國 Gbico公司；顯影液：美國Millipore公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）：美國 Pall Corporation 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）：上海普邁生物科技有限公司；磷脂酰肌醇-3-激酶 p110亞基（Phosphatidylinositol-3-kinasep110，PI3Kp110）、磷脂酰肌醇-3-激酶 p85 亞基（Phosphatidylinositol-3-kinase-p85，PI3Kp85）一抗、蛋白激酶（phosphorylated protein kinase，AKT）、Phospho-AKT（Ser473）一抗、糖原合酶激酶 3β（glycogen synthase kinase-3β，p-GSK3β）、Phospho-GSK3β（Ser389）一抗 、胰島素受體底物1（recombinant insulin receptor substrate 1，IRS1）一抗：萊恩生物科技有限公司；葡萄糖轉運體-4（glucose transporters-4，GLUT-4）：武漢菲恩生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

3503-2 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱：美國Shellab公司；AE2000熒光倒置顯微鏡：麥克奧迪電氣股份有限公司；2-16R高速冷凍離心機：湖南恒諾儀器設備有限公司；Multiskan Mk3型酶標儀：賽默飛世爾儀器有限公司；UV2000紫外分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋、800YY型中草藥粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司；Spark多功能酶標儀：瑞士TECAN；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀：上海雅榮生化儀器設備公司；101-4AB電熱恒溫干燥箱：北京中星偉業(yè)儀器有限公司；2-16R離心機：湖南恒諾儀器設備有限公司；XS205專業(yè)型分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

2 方法

2.1 靈芝醇提物制備

靈芝子實體，粉碎，過10目篩，取過篩靈芝子實體粉末100g，以80%的乙醇作為提取試劑，料液按照質(zhì)量比1∶20，提取溫度為 70℃，回流提取3次，每次1.2 h[9]。過濾，合并濾液，用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮，得靈芝醇提物浸膏，蒸干浸膏得到靈芝醇提物1.146 g。

2.2 3T3-L1前脂肪細胞培養(yǎng)與誘導分化

細胞培養(yǎng)：將3T3-L1前脂肪細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱完全培養(yǎng)液）于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每2 d進行一次換液處理。

誘導分化：取對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)板，待細胞長滿后，使其接觸抑制48 h。48h過后，換入成脂誘導劑一（含 0.5 mmoL/L IBMX，0.25 μmoL/L DEX，1 mg/L胰島素，2 μmoL/L羅格列酮的完全培養(yǎng)液）培養(yǎng)48h，到達處理時間后，換入成脂誘導劑二（含1mg/L胰島素的完全培養(yǎng)液）繼續(xù)培養(yǎng)48 h完成誘導[10]。后續(xù)更換為完全培養(yǎng)液，每2 d換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)8天，待有占比90%以上細胞出現(xiàn)“戒環(huán)”狀脂滴即可用于試驗。

2.3 油紅“O”染色

使用油紅“O”染色法鑒定3T3-L1細胞的分化程度[11]。飽和油紅氧按照體積比3∶2（油紅氧∶蒸餾水）加入蒸餾水配制成油紅“O”的工作液，混勻，室溫放置5 min～10 min，過濾后使用。去除細胞板中的完全培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，使用甲醛-鈣固定10 min，蒸餾水充分洗滌，60%異丙醇侵洗，油紅“O”染液染色10 min，60%異丙醇分化至間質(zhì)清晰，Mayer蘇木素復染1 min，蒸餾水洗，使用倒置顯微鏡拍照觀察。

2.4 靈芝醇提物對脂肪細胞存活率的影響

通過CCK8試劑盒測定細胞活力。細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，待貼壁以后，使用10、50、10、500、1 000 mg/L 的靈芝醇提物處理 24 h，處理時間到達后換入10%CCK8檢測液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，于

2.5 脂肪細胞胰島素抵抗模型建立

細胞以5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，分為正常組與建模組，正常組使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，建模組使用1 μmol/L的地塞米松，分別處理脂肪細胞24、48、72 h，處理時間到達后，選擇加入或者不加100 nm的胰島素刺激脂肪細胞30 min。刺激結束后取出培養(yǎng)液，采用葡萄糖氧化酶法檢測葡萄糖含量，計算出葡萄糖消耗量，計算公式：葡萄糖消耗量/（mmol/L）＝原DMEM培養(yǎng)基葡萄糖含量-實驗組培養(yǎng)基葡萄糖含量。

培養(yǎng)板繼續(xù)加入10%CCK8檢測液，孵育1 h，在450 nm波長處檢測吸光度，計算出細胞存活率，計算公式同2.4。

2.6 模型穩(wěn)定性檢測

建立胰島素抵抗模型后，將正常組與模型組同時在完全培養(yǎng)基中孵育24 h，孵育完成后檢測細胞存活率以及葡萄糖消耗量，檢測方法同2.4和2.5。

2.7 靈芝醇提物處理胰島素抵抗模型

為了說明靈芝醇提物對地塞米松誘導的胰島素抵抗模型的影響，選擇10、50、100 mg/L 3個濃度的靈芝醇提物在胰島素抵抗模型中進行劑量反應分析。實驗設置正常組，模型組，低、中、高劑量靈芝醇提物給藥組（濃度分別為10、50、100 mg/L靈芝醇提物），二甲雙胍陽性對照組（濃度為100 mg/L）。加藥物24 h后吸出培養(yǎng)液，使用葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)液中葡萄糖含量，計算出各組葡萄糖消耗量，計算方法同2.5。

2.8 甘油三脂含量檢測

細胞處理與分組方法同2.7。處理完成后收集細胞，使用裂解液裂解細胞30 min，采用甘油三酯試劑盒檢測甘油三酯的含量，計算公式：甘油三酯含量/（mmol/L）＝實驗組吸光度/正常組吸光度×標準品濃度/實驗組蛋白濃度。

2.9 Western blot檢測

實驗設置正常組，模型組（1 μmoL/L地塞米松的完全培養(yǎng)基處理脂肪細胞72 h），治療組（1 μmoL/L地塞米松處理脂肪細胞72 h后使用10 mg/L靈芝醇提物的完全培養(yǎng)基處理24 h）。利用 Western blot法，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，檢測IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、AKT，p-AKT（Ser473）、GSK3β，p-GSK3β（Ser-389）蛋白表達水平。

細胞培養(yǎng)板放置于冰面上，棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)450 nm波長處檢測吸光度，計算細胞存活率，計算公式如下?；?，加入PBS洗滌2次，加入蛋白裂解液裂解10 min，用槍吹打裂解液使細胞裂解完全。收集裂解液，4℃離心，14 000 r/min離心3 min取上清，加入5倍上樣緩沖液，100℃金屬浴10min。BCA法測定蛋白濃度。配制10%的SDS-PAGE凝膠分離蛋白；使用濕轉法（250 mA，1.5 h）將蛋白質(zhì)轉移至0.22 μm PVDF膜上，轉膜結束后PVDF膜加入封閉液封閉1 h；使用1×TBST洗PVDF膜3次，每次10 min；加入一抗蛋白4℃過夜，回收一抗，1×TBST洗PVDF膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔或者抗鼠孵育1 h，充分洗滌，加入顯影液，放入化學發(fā)光凝膠成像儀檢測[12]。

2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所得結果使用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)采用t檢驗統(tǒng)計分析。

3 結果

3.1 3T3-L1成熟脂肪細胞的誘導

3T3-L1成熟脂肪細胞的誘導見圖1。

圖1 脂肪細胞誘導Fig.1 Adipocyte induction

細胞生長密度占比達80%以上后使細胞保持接觸抑制狀態(tài)2 d，細胞退出生長周期，形狀為細條形的梭狀。誘導分化的第2天，細胞由梭狀開始變圓（圖1A），誘導分化的第6天，大量細胞變圓（圖1B）。誘導分化的第10天，細胞有圓形大脂滴聚集在細胞中心，少量細胞呈現(xiàn)出“戒環(huán)”狀結構的形狀（圖1C）。第12天時，分化為成熟的3T3-L1脂肪細胞占比90%以上，脂滴分布于細胞質(zhì)中，出現(xiàn)“戒環(huán)”狀結構（圖1D）。油紅“O”染色可觀察到脂肪細胞中油脂呈紅色，細胞核呈藍色，間質(zhì)無色，紅色的脂滴呈“戒環(huán)”狀分布于細胞中（圖1E、1F）。上述實驗結果表明，3T3-L1前脂肪細胞已經(jīng)成功分化為成熟的脂肪細胞。

3.2 靈芝醇提物對脂肪細胞活力的影響

靈芝醇提物對脂肪細胞活力的影響如圖2所示。

圖2 靈芝醇提物對細胞存活率的影響Fig.2 Effect of Ganoderma lucidum ethanol extract on cell survival rate

如圖2所示，500、1 000 mg/L靈芝醇提物處理組與正常組相比較極顯著降低（P＜0.01）。10、50、100 mg/L靈芝醇提物處理組的細胞存活率沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05），對脂肪細胞沒有毒性。因此，后續(xù)實驗選擇10、50、100 mg/L進行實驗。

3.3 胰島素抵抗模型建立

胰島素抵抗模型建立結果如圖3所示。

圖3 建立胰島素抵抗模型Fig.3 Insulin resistance model

通過脂肪細胞葡萄糖消耗量來判斷脂肪細胞胰島素抵抗程度，1 μmoL/L地塞米松處理的3T3-L1細胞，脂肪細胞葡萄糖消耗量隨著地塞米松處理的時間增加而逐漸減少（圖3B）。在24、48 h內(nèi)與正常組比無極顯著差異，在72 h時與正常組相比細胞葡萄糖消耗量出現(xiàn)極顯著抑制（P＜0.01）。因此選擇1 μmoL/L的地塞米松處理72 h為模型組。地塞米松處理組與正常組比較細胞存活率并沒有顯著性的差異，排除細胞死亡產(chǎn)生的實驗干擾（圖3A）。

3.4 模型穩(wěn)定性

模型穩(wěn)定性結果見圖4。

圖4 模型穩(wěn)定性分析Fig.4 Model stability analysis

1 μmoL/L地塞米松處理脂肪細胞72 h建立胰島素抵抗模型組，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，模型組與正常組相比，脂肪細胞的葡萄糖消耗量極顯著被抑制（P＜0.01）（圖4），表明 24 h內(nèi)該模型維持穩(wěn)定。

3.5 靈芝醇提物改善脂肪細胞的胰島素抵抗

靈芝醇提物改善脂肪細胞的胰島素抵抗結果見圖5。

圖5 靈芝醇提物改善胰島素抵抗Fig.5 Ganoderma lucidum ethanol extract improves insulin resistance

如圖5所示，靈芝醇提物給藥干預24 h后，10、50、100 mg/L靈芝醇提物均促進了脂肪細胞胰島素抵抗模型的葡萄糖消耗，分別為20.6%、33.7%、40.6%（圖5B）。靈芝醇提物能顯著逆轉地塞米松導致的胰島素抵抗且具有劑量依賴性。各組細胞使用CCK8測定細胞活力，細胞存活率沒有統(tǒng)計學差異（圖5A）。由此說明，靈芝醇提物確實能改善地塞米松誘導的胰島素抵抗。

3.6 靈芝醇提物促進脂肪細胞脂質(zhì)積累

靈芝醇提物對脂肪細胞甘油三酯的影響如圖6所示。

圖6 靈芝醇提物對甘油三酯的影響Fig.6 Effect of Ganoderma lucidum ethanol extract on triglyceride

經(jīng)過地塞米松處理之后，模型組細胞甘油三酯含量與正常組相比極顯著下降（P＜0.01）。靈芝醇提物處理細胞24 h顯著增加了脂肪細胞的甘油三酯含量且呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）。由此說明，靈芝醇提物可以改善脂肪細胞胰島素抵抗，改善脂肪細胞脂質(zhì)代謝紊亂。

3.7 靈芝醇提物改善脂肪細胞胰島素抵抗相關蛋白的表達

蛋白表達結果見圖7。

圖7 靈芝醇提物對胰島素信號通路的影響Fig.7 Effect of Ganoderma lucidum ethanol extract on insulin signaling pathway

靈芝醇提物處理脂肪細胞胰島素抵抗模型24 h，Western blot法檢測 IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β 蛋白的表達。與正常組比較，模型組細胞的 IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、p-AKT、p-GSK3β蛋白表達明顯下降；靈芝醇提物處理 24 h 后 IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、p-AKT、p-GSK3β蛋白表達上升。結果表明，靈芝醇提物能通過改善脂肪細胞胰島素抵抗模型IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、p-AKT、p-GSK3β 蛋白的表達改善脂肪細胞胰島素抵抗。

4 討論與結論

胰島素抵抗在脂肪細胞中主要表現(xiàn)為脂肪細胞糖攝取、脂肪合成的減少及對脂解作用抑制的減弱[4]。脂肪組織胰島素抵抗是代謝紊亂疾病的主要病理特征之一[4]。隨著生活質(zhì)量的提高，代謝紊亂疾病發(fā)病率逐年上升[13]。改善脂肪細胞胰島素抵抗對于改善代謝紊亂疾病十分重要。

地塞米松是糖皮質(zhì)激素的一種，而糖皮質(zhì)激素是胰島素抵抗的有效激活劑和胰島素分泌的抑制劑，地塞米松誘導3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗使用較早，是經(jīng)典的模型[5]。使用地塞米松處理脂肪細胞的時間越長胰島素抵抗效果越強，本試驗中地塞米松處理脂肪細胞72 h時胰島素抵抗程度最高，與Luan等[14]的結果一致。IRS-1、PI3K 和 AKT（IRS1/PI3K/AKT）信號通路是胰島素信號轉導的主要途徑[15]。在正常的脂肪細胞中，胰島素與胰島素受體相互作用后，IRS-1被激活，啟動下游信號轉導通路PI3K和AKT信號通路[15]。p-AKT調(diào)節(jié)糖原合成酶激酶-3β的活性，最終刺激脂質(zhì)的合成[16]。本試驗結果顯示，地塞米松處理脂肪細胞72 h 后 IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、p-AKT、p-GSK3β蛋白表達下降，與Yang等[17]結果一致，地塞米松引起脂肪細胞胰島素抵抗主要是由于胰島素受體損傷、PI3K活化受損以及葡萄糖轉運蛋白受損[18]。

靈芝具有抗腫瘤、增強免疫功能、降血糖等多種藥理作用[6]。有研究表明靈芝顆?？梢酝ㄟ^減輕機體炎癥狀態(tài)治療2型糖尿病，可明顯降低2型糖尿病患者的血糖水平，有效改善胰島素抵抗[19]。本實驗中10、50、100 mg/L的靈芝醇提物均促進了葡萄糖消耗量以及甘油三酯的積累，促進程度與靈芝醇提物劑量呈正比。Western blot結果顯示，靈芝醇提物促進了IRS1的表達，改善了模型組胰島素受體損傷；激活了PI3K/AKT，促進胰島素信號轉導；增加了GLUT4蛋白的表達，促進了葡萄糖轉運；激活了GSK3β，促進脂肪細胞脂質(zhì)的合成。

綜上所述，靈芝醇提物可有效改善脂肪細胞的胰島素抵抗且呈現(xiàn)劑量依賴性。其作用機制可能是通過激活IRS1/PI3K/AKT通路，促進葡萄糖的吸收，促進脂質(zhì)合成，改善了脂肪細胞胰島素抵抗以及糖脂代謝紊亂。本研究討論了靈芝醇提物改善胰島素抵抗的分子機制，為靈芝的臨床使用及綜合利用提供理論基礎。然而，靈芝醇提物改善胰島素抵抗相關機制的研究以及臨床應用還需大量學者的努力。