滇橄欖水提物對(duì)洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘小鼠癥狀的改善作用

李思錦，高曉余，2*，李桂蘭，羅開蓮，白忠彬，胡一凡，盛軍，田洋，2，.*

（1．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；3．云南省生物大數(shù)據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；4．云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201）

生活節(jié)奏快、工作壓力大、飲食不規(guī)律和熬夜等多種因素使得便秘患病率有所增加，且患病人群有年輕化趨勢(shì)[1]。目前，治療便秘主要依靠西藥和中成藥。西藥主要為膨脹性瀉劑、刺激性瀉劑、滲透性瀉劑和促動(dòng)力劑[2]。長(zhǎng)期使用藥物會(huì)引發(fā)多種副作用并對(duì)藥物產(chǎn)生依賴性[3]，副作用包括腹脹、痙攣、惡心、頭痛和嘔吐等[4]，而使用天然植物膳食制劑可有效避免這些問題[1]。腸道敏感性降低、濫用瀉藥是便秘的主要原因[5]，研究表明低纖維飲食會(huì)誘導(dǎo)便秘，高纖維飲食可促進(jìn)糞便排泄，縮短結(jié)腸傳輸時(shí)間[6]。富含可溶性膳食纖維的食物被證明對(duì)改善便秘有益[7]。不僅大分子物質(zhì)具有通便作用，中草藥中的一些小分子化合物也具有通便作用，如甾體皂甙[8]、槲皮素[9]和柚皮素[10]等。飲食療法往往比藥物療法有更好的依從性，這有助于更好地治療便秘[4]?！吨袊?guó)藥典》記載，余甘子可用于防治消化不良、血熱血瘀、腹脹、咳嗽等。余甘子富含酚類、維生素、氨基酸、黃酮等生物活性物質(zhì)，具有很好的抗氧化、抗腫瘤、降血糖、護(hù)肝等活性和藥理作用，同時(shí)還具有突出的抗炎功效[11]。滇橄欖（又名云南余甘子）在潤(rùn)腸通便方面可能具有良好的作用效果，但這一方向的研究較少。滇橄欖具有很好的加工性能，在藥品和保健食品開發(fā)方面具有較大的潛力[12]。本研究以滇橄欖為原料，制備其水提物，采用洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘小鼠模型，從糞便性狀和腸道蠕動(dòng)兩個(gè)方面明確滇橄欖的潤(rùn)腸通便作用，以期為開發(fā)以滇橄欖為原料的通便功能食品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滇橄欖（P.emblica）：云南省普洱市寧洱縣。

昆明種小鼠（無特定病原體動(dòng)物）：72只，17g～20g，成都達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司，飼喂在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

麻仁丸：北京同仁堂股份有限公司；洛哌丁胺：默克生命科學(xué)（上海）有限公司；阿拉伯樹膠、活性炭粉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

20目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩：浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；BSA124S-CW電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)：上海比朗儀器制造有限公司；TGL20M大型高速離心機(jī)：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；DZF-6020真空干燥箱：予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 滇橄欖水提物制備

滇橄欖的食用方式主要為口含、泡服或咀嚼，因此本實(shí)驗(yàn)以滇橄欖水提物為原料進(jìn)行功效評(píng)價(jià)。選擇新鮮、色澤淡黃、成熟度適宜、無霉變腐爛的滇橄欖，用流動(dòng)水充分洗凈后去核，切成小塊備用。精密稱量100 g滇橄欖果實(shí)小塊，以料液比1∶10（g/mL）加入到1 000 mL超純水中，混勻后沸水煮3min，立即過濾。將濾渣繼續(xù)以料液比1∶10（g/mL）加入到1 000 mL超純水中，沸煮1 min，立即過濾，繼續(xù)重復(fù)此操作1次。將3次的濾液混合后于大型高速離心機(jī)離心（4 000 r/min，10 min），取上清液真空冷凍干燥，得滇橄欖水提物。

1.3.2 洛哌丁胺的配制

精確稱量400 mg洛哌丁胺，溶于50 mL 0.9%生理鹽水中，使其終濃度為8 mg/mL，備用。

1.3.3 麻仁丸混懸液的配制

將麻仁丸（6 g/丸）溶解在0.9%生理鹽水中至終濃度為60 mg/mL，備用。

1.3.4 墨汁的配制

精確稱量20 g阿拉伯樹膠和10 g活性炭粉，量取160 mL蒸餾水，將阿拉伯樹膠加入水中煮沸至透明，加入活性炭粉，煮沸3次。溶液冷卻后，用蒸餾水稀釋至 200 mL，備用[13]。

1.3.5 動(dòng)物分組及給藥

洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘模型主要是通過抑制腸道蠕動(dòng)、影響腸道水代謝和腸神經(jīng)系統(tǒng)而形成便秘[14]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（n=12），同時(shí)設(shè)置300、600、900 mg/（kg·d）3個(gè)滇橄欖水提物劑量組（n=12）?？瞻讓?duì)照組灌胃0.9%生理鹽水；模型對(duì)照組灌胃8 mg/（kg·d）洛哌丁胺；陽(yáng)性對(duì)照組灌胃900 mg/（kg·d）的麻仁丸混懸液；3個(gè)劑量組分別灌胃相應(yīng)濃度受試物和洛哌丁胺8 mg/（kg·d），所有樣品采用0.9%生理鹽水配制成所需濃度。連續(xù)7 d每日經(jīng)口灌胃1次，灌胃量均為0.125 mL/10 g bw。

1.3.6 排便實(shí)驗(yàn)

根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》開展小鼠排便實(shí)驗(yàn)。受試物干預(yù)的第6天晚上，對(duì)各組小鼠撤食不撤水。12 h后，給各劑量組灌胃生理鹽水和相應(yīng)受試物，并在1 h后對(duì)各組小鼠進(jìn)行墨汁灌胃并開始計(jì)時(shí)。將灌胃完畢的小鼠分別置于獨(dú)立籠內(nèi)，給予充足水源，記錄每只小鼠首粒排黑便時(shí)間，收集6 h內(nèi)每只小鼠排出的糞便，統(tǒng)計(jì)其粒數(shù)和糞便總質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將收集好的糞便樣品置于真空干燥箱中，在50℃條件下干燥至恒重。按照公式：糞便含水率/%=[糞便濕重（g）-糞便干重（g）]/糞便濕重（g）×100，計(jì)算各組小鼠的糞便含水率。

1.3.7 小腸墨汁推進(jìn)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》開展小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)。灌胃相應(yīng)受試物的第7天晚上，對(duì)各組小鼠進(jìn)行饑餓處理。12 h后，各劑量組灌胃生理鹽水和相應(yīng)受試物。1 h后灌胃墨汁作為指示劑，20 min后立即處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取自幽門至回盲部的腸組織，將小腸平鋪，測(cè)量得到小腸長(zhǎng)度，從幽門至墨汁前沿的長(zhǎng)度為小腸墨汁推進(jìn)距離。按照公式：小腸墨汁推進(jìn)率/%=墨汁推進(jìn)距離（cm）/小腸長(zhǎng)度（cm）×100，計(jì)算各組小鼠的小腸墨汁推進(jìn)率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad prism 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》采用獨(dú)立T檢驗(yàn)（兩尾法）分析組別間的差異顯著性。若6 h內(nèi)糞便總質(zhì)量和6 h內(nèi)糞便粒數(shù)其中一項(xiàng)結(jié)果陽(yáng)性（p＜0.05），同時(shí)小腸墨汁推進(jìn)率和首粒排黑便時(shí)間其中一項(xiàng)結(jié)果陽(yáng)性（p＜0.05），即可判定該受試樣品有助于通便。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇橄欖水提物對(duì)便秘小鼠基礎(chǔ)機(jī)體指標(biāo)的影響

滇橄欖水提物對(duì)便秘小鼠基礎(chǔ)機(jī)體指標(biāo)的影響見圖1。

圖1 小鼠基礎(chǔ)機(jī)體指標(biāo)變化情況Fig.1 Changes in basic body indexes of mice

如圖1所示，實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體質(zhì)量均正常增長(zhǎng)，攝食量、飲水量以及各臟器指數(shù)各組間無顯著性差異（p>0.05）。表明滇橄欖水提物和各受試物未對(duì)小鼠基礎(chǔ)機(jī)體指標(biāo)造成明顯影響。

2.2 滇橄欖水提物對(duì)便秘小鼠排便參數(shù)的影響

為明確滇橄欖水提物對(duì)便秘小鼠排便影響，在灌胃滇橄欖水提物等相應(yīng)受試物的第7天進(jìn)行排便實(shí)驗(yàn)，記錄每組小鼠6 h內(nèi)的糞便總質(zhì)量和糞便粒數(shù)、首粒排黑便時(shí)間及糞便含水率，結(jié)果見圖2。

圖2 滇橄欖水提物對(duì)便秘小鼠排便的影響Fig.2 Effect of aqueous extract of P.emblica on defecation in mice with constipation

由圖2可知，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的6h內(nèi)糞便總質(zhì)量減少0.122 g（p＜0.05），首粒排黑便時(shí)間增加 61 min（p＜0.05），糞便含水率下降為 46%（p＜0.01），6 h內(nèi)糞便粒數(shù)減少 4粒（p＜0.05），表明功能性便秘小鼠模型建立成功。

與模型對(duì)照組相比，滇橄欖水提物中、高劑量組小鼠的6 h內(nèi)糞便總質(zhì)量分別增加0.23（p＜0.01）、0.17 g（p＜0.05），糞便含水率分別增加至 64%、61%（p＜0.001），6 h內(nèi)糞便粒數(shù)分別增加4粒和 5粒（p＜0.05），高劑量組首粒排黑便時(shí)間縮短80 min（p＜0.01）。結(jié)果表明，中、高劑量滇橄欖水提物對(duì)小鼠功能性便秘有較好的改善作用。

2.3 滇橄欖水提物對(duì)便秘小鼠小腸蠕動(dòng)的影響

滇橄欖水提物對(duì)便秘小鼠小腸蠕動(dòng)的影響見圖3。

圖3 滇橄欖水提物對(duì)便秘小鼠小腸蠕動(dòng)的影響Fig.3 Effect of aqueous extract of P.emblica on intestinal peristalsis in mice with constipation

物質(zhì)在小腸內(nèi)的運(yùn)動(dòng)速率即胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)率為受試物是否具有潤(rùn)腸通便功效的重要參考。小腸墨汁推進(jìn)率及小腸長(zhǎng)度可反映滇橄欖水提物對(duì)便秘小鼠胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)率的影響。由圖3A可知，各組小鼠小腸長(zhǎng)度差異性不顯著（p>0.05）。與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠的小腸墨汁推進(jìn)率降低至41%，兩組間差異高度顯著（p＜0.001）。與模型對(duì)照組相比，低、中、高劑量滇橄欖水提物均能顯著提升小鼠小腸墨汁推進(jìn)率，分別提升至57%、60%、65%，差異性均高度顯著（p＜0.001），表明滇橄欖水提物可有效促進(jìn)便秘小鼠小腸蠕動(dòng)。

3 討論與結(jié)論

便秘是一種常見的慢性胃腸道疾病，可分為功能性便秘和器質(zhì)性便秘。功能性便秘是指無器質(zhì)性或結(jié)構(gòu)性疾病的硬便和少便[15]。心理壓力、飲食或營(yíng)養(yǎng)問題被認(rèn)為是功能性便秘的主要誘導(dǎo)因素[16-17]。現(xiàn)階段，西藥和中成藥是治療功能性便秘的主要手段。這些藥物可以通過抑制腸道炎癥、改善腸道屏障系統(tǒng)、調(diào)節(jié)腸道菌群來恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡，也可通過調(diào)節(jié)腸道組織水通道蛋白表達(dá)，提高內(nèi)含物含水率起到潤(rùn)腸的作用，還可以調(diào)節(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)，通過促進(jìn)平滑肌活動(dòng)和功能的恢復(fù)來促進(jìn)腸道蠕動(dòng)[18]。長(zhǎng)期使用西藥會(huì)引發(fā)多種副作用，而天然膳食制劑副作用小，與飲食結(jié)合，往往具有很好的治療效果。

研究發(fā)現(xiàn)，香蕉低聚糖能改變腸道微生物菌落的組成，達(dá)到預(yù)防便秘效果[19]；葛仙米藻粉能夠通過調(diào)節(jié)腸神經(jīng)遞質(zhì)，如5-羥色胺、血管活性腸肽含量的分泌、水通道蛋白的表達(dá)改來善便秘癥狀[20]。裙帶菜多糖及其寡糖通過調(diào)節(jié)腸道菌群失衡、修復(fù)腸道屏障的方式治療便秘[21]；核桃青皮酵素可加強(qiáng)小鼠腸道蠕動(dòng)，促進(jìn)腸道的消化吸收，具有良好的潤(rùn)腸通便功效[22]。魔芋葡甘聚糖通過干預(yù)神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)，提高胃動(dòng)素和乙酰膽堿酯酶水平，降低內(nèi)皮素、5-羥色胺和NO水平，能有效緩解便秘患者的臨床癥狀[23]；天然產(chǎn)物滸苔多糖通過上調(diào)結(jié)腸5-羥色胺的表達(dá)能夠改善洛哌丁胺誘導(dǎo)的小鼠便秘癥狀[24]。采用食品或天然提取物防治便秘已經(jīng)成為一種趨勢(shì)。

本研究采用洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘小鼠模型，從糞便性狀和腸道蠕動(dòng)兩個(gè)方面研究滇橄欖水提物的潤(rùn)腸通便作用。研究結(jié)果表明，與模型對(duì)照組小鼠相比，中、高劑量滇橄欖水提物[600、900 mg/（kg·d）]可顯著促進(jìn)便秘小鼠的小腸蠕動(dòng)，首粒排黑便時(shí)間縮短（其中高劑量組差異極顯著），6 h內(nèi)糞便總質(zhì)量和糞便粒數(shù)以及糞便含水率顯著增加，小腸墨汁推進(jìn)率顯著提升，通便效果與麻仁丸接近。滇橄欖水提物在促進(jìn)腸道蠕動(dòng)及增加糞便含水量方面存在顯著作用，說明滇橄欖潤(rùn)腸通便作用可能與腸道水通道蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)有關(guān)。推測(cè)滇橄欖水提物通過調(diào)節(jié)水通道蛋白3和水通道蛋白4的表達(dá)，改變腸道組織水分吸收方式，進(jìn)而改善便秘。此外，研究表明滇橄欖水提物對(duì)小鼠飲食、體質(zhì)量以及臟器指數(shù)均無顯著影響，實(shí)驗(yàn)期間小鼠未出現(xiàn)腹瀉、精神狀態(tài)不佳等明顯毒副作用，表明滇橄欖水提物具有較好的安全性。滇橄欖水提物可顯著改善洛哌丁胺誘導(dǎo)的小鼠便秘癥狀，具有可靠、溫和的潤(rùn)腸通便功效。