高效液相色譜法同時(shí)測定阿膠糕中16 種防腐劑

趙艷霞，張棟，姜巖，郭瑩，周維利，高天陽，謝強(qiáng)勝

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101；2.國家市場監(jiān)督管理總局食品審評(píng)中心，北京 100070)

食品防腐劑是一種最為常見的食品添加劑，在食品加工中得到廣泛應(yīng)用[1-2]。食品防腐劑可有效保持食品的鮮度、防止食品變質(zhì)腐敗，延長食品的保鮮期與食用時(shí)間，給消費(fèi)者日常生活帶來極大便利。隨著居民生活水平的提高，消費(fèi)者越來越關(guān)注食品的安全性問題，對防腐劑的使用情況也越來越重視[3-4]。防腐劑的過量添加會(huì)對人體造成一定傷害[5-6]，目前防腐劑的應(yīng)用已有濫用趨勢，食品安全面臨風(fēng)險(xiǎn)隱患。

阿膠糕是由阿膠、核桃仁、黑芝麻、冰糖及黃酒等加工制作而成，可滋陰潤燥，對血虛、面色萎黃、眩暈、心悸、心煩不眠、肺燥咳嗽等病癥有較好的滋補(bǔ)效果。為了延長阿膠糕的保存時(shí)間，防止其腐敗變質(zhì)，通常添加適量防腐劑。但是食入過量防腐劑對人體具有潛在的致畸、致癌和致突變性。

目前測定食品中防腐劑的方法主要有液相色譜法[7-11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-14]、氣相色譜法[15-17]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18-20]等，尚無阿膠糕中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸等防腐劑的測定方法。為了解阿膠糕中防腐劑使用情況，并提高檢驗(yàn)效率、節(jié)約成本，筆者建立了高效液相色譜法同時(shí)測定阿膠糕中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸等16 種防腐劑的測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-40D 型，日本島津公司。電子天平：XSE205 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

高速萬能粉碎機(jī)：JFSD-100 型，上海嘉定糧油儀器有限公司。

恒溫?cái)?shù)控超聲儀：Sb3200 型，昆山市超聲儀器有限公司。

渦旋振蕩器：Vortex-6型，長春樂鏷科技有限公司。

超純水機(jī)：Milli-QA-10 型，默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(上海)有限公司。

水楊酸、苯甲酸對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.9%、99.1%，中國食品藥品檢定研究院。

脫氫乙酸、苯氧異丙醇、2，6-二氯苯甲醇、σ-傘花烴-5-醇、氯二甲酚、氯咪巴唑、芐氯酚、三氯卡班對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100.0%、95.2%、99.8%、99.9%、99.3%、99.1%、97.1%、99.4%，北京曼哈格生物科技有限公司。

山梨酸、硫柳汞鈉對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.5%、98.8%，安諾倫(北京)生物科技有限公司。

苯甲酸甲酯、對氯間甲酚、2，4-二氯苯甲醇對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分?jǐn)?shù)為99.9%、99.7%、99.7%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

碘丙炔醇丁基氨甲酸酯對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%，德國Dr Ehrenstorfer 公司。

甲醇：色譜純，美國Sigma 公司。

磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、鹽酸、磷酸：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

阿膠糕樣品：市售，共15 批次.

陰性樣品：自制。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典Akzo Nobel 公司)；流動(dòng)相：A 相為0.025 mol/L 磷酸二氫鈉溶液(含0.02 mmol/L EDTA-2Na，pH 3.8)，B 相為甲醇，流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：230 nm；柱溫：35 ℃；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0.00～10.0 min 時(shí)A 相體積分?jǐn)?shù)為55%，10.0～27.0 min 時(shí)A 相體積分?jǐn)?shù)由55%漸變?yōu)?0%，27.0～42.0 min 時(shí)A 相體積分?jǐn)?shù)由30%漸變?yōu)?5%，保持7 min，49.0～50.0 min 時(shí)A 相體積分?jǐn)?shù)由15%漸變?yōu)?5%，保持5 min。

1.3 溶液配制

16 種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，分別取水楊酸、苯甲酸、脫氫乙酸、山梨酸、苯氧異丙醇、2，6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、對氯間甲酚、2，4-二氯苯甲醇、σ-傘花烴-5-醇、氯二甲酚、氯咪巴唑、芐氯酚、三氯卡班、硫柳汞鈉各10.0 mg，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標(biāo)線，搖勻。

16 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度均為0.04 mg/mL，分別精密量取16 種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各2.0 mL，置于同一只50 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻。

16 種防腐劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用甲醇將16 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至各組分質(zhì)量濃度均分別為20、50、100、250、500 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。

1.4 樣品處理

取樣品約20 g，置于粉碎機(jī)中粉碎，混勻。精密稱取樣品1.0 g，置于50 mL 塑料離心管中，加水10 mL，超聲使樣品溶散，加入0.03 mol/mL 鹽酸溶液1 mL 和1%乙酸鋅溶液-1%亞鐵氰化鉀溶液（體積比為1∶1）2 mL，用甲醇定容至25 mL，以3 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，用0.22 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液作為待測樣品溶液。同法制備陰性樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法選擇

分別采用超聲處理法和水浴回流提取法處理樣品，考察不同提取方式對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，超聲提取法可完全提取出所測防腐劑成分，且超聲處理方法簡單、快速，故選擇超聲處理法。

將樣品置于恒溫?cái)?shù)控超聲儀中，分別超聲提取10、30、60 min，考察不同提取時(shí)間對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，超聲提取30 min 溶液所得色譜峰面積大于超聲提取10 min 溶液所得色譜峰面積，而與超聲提取60 min 溶液相比，樣品色譜峰面積無顯著性差異，故選擇超聲處理30 min。

分別使用30%三氯乙酸溶液、1%乙酸鋅溶液-1%亞鐵氰化鉀溶液對樣品進(jìn)行除蛋白方式考察。結(jié)果表明，使用1%乙酸鋅溶液-1%亞鐵氰化鉀溶液去除蛋白，所得溶液色譜峰面積大于使用30%三氯乙酸溶液去除蛋白所得溶液色譜峰面積，故選擇用1%乙酸鋅溶液-1%亞鐵氰化鉀溶液去除蛋白。

2.2 色譜條件選擇

固定其它分析條件不變，分別選擇230、280 nm作為檢測波長進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種檢測波長下樣品測定結(jié)果無明顯差異，結(jié)合文獻(xiàn)[10]，選擇檢測波長為230 nm。

固定其它分析條件不變，分別選擇磷酸二氫鈉溶液-甲醇、磷酸二氫鈉溶液-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，選擇磷酸二氫鈉溶液-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰形尖銳，基線更平穩(wěn)，故選擇磷酸二氫鈉溶液-甲醇作為流動(dòng)相。

固定其它分析條件不變，分別選擇柱溫為30、35、40 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，除保留時(shí)間略有不同外，測定結(jié)果無明顯差異，故選擇柱溫為35 ℃。

2.3 線性方程與檢出限

在1.2 色譜條件下，對16 種防腐劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以待測防腐劑的質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為自變量、色譜峰面積(y)為因變量進(jìn)行線性回歸，計(jì)算16 種防腐劑的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以甲醇為溶劑，逐級(jí)稀釋16 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2 色譜條件下進(jìn)行測定，以3 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作方法為檢出限，以10 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限。

16 種防腐劑質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表1。由表1 可知，16 種防腐劑的質(zhì)量濃度在20～500 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 5。

表1 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

在阿膠糕陰性樣品中添加3 種不同質(zhì)量濃度水平的16 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4 樣品處理方法平行處理3 份加標(biāo)樣品溶液，在1.2 色譜條件下分別進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由表2 可知，16 種防腐劑加標(biāo)回收率為98.8%～102.5%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.78%～2.36%，表明該方法精密度、準(zhǔn)確度良好。

表2 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 專屬性試驗(yàn)

分別精密量取空白樣品溶液、16 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液各10 μL 進(jìn)行分析，考察空白樣品溶液中其它成分對待測成分色譜峰的干擾情況，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看出，陰性樣品在標(biāo)準(zhǔn)品的各組分相應(yīng)出峰時(shí)間位置處無雜質(zhì)峰干擾，表明該方法專屬性強(qiáng)。

圖1 空白樣品溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液色譜圖

3 結(jié)語

建立了阿膠糕中16 種防腐劑高效相色譜測定方法，該方法樣品處理簡單，測定結(jié)果重現(xiàn)性好，靈敏度高，目標(biāo)物色譜分離度好，方法專屬性強(qiáng)，可以滿足阿膠糕中防腐劑的定性與定量測定要求，為阿膠糕質(zhì)量控制、安全評(píng)價(jià)提供了技術(shù)依據(jù)。