金釵石斛提取物對5種耐藥菌的體外抑菌活性評價

王建梅，王國盼，陸安靜，秦 琳，魯艷柳，白朝鈞，何芋岐，譚道鵬

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州金釵石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)工程研究中心，貴州 遵義 563099；2.貴州納蒂爾生物科技有限公司，貴州 遵義 563000)

細(xì)菌進(jìn)化選擇是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因，而近些年抗生素的濫用更加劇了耐藥菌的產(chǎn)生，為臨床用藥有效性及安全性帶來了極大挑戰(zhàn)[1]。金黃色葡萄球菌是自然界分布最廣泛的革蘭氏陽性球菌之一，也是引起疾病最重要的致病菌之一；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)對β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類抗生素均耐藥，并可能對氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類等抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥[2]。大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)、銅綠假單胞菌(PA)和肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae,Kleb)也是臨床較為常見的條件致病菌，均有嚴(yán)重的多重耐藥性[3]。由于抗生素和抗菌藥物的廣泛使用，耐藥菌現(xiàn)象的產(chǎn)生無法避免。中醫(yī)藥強調(diào)人與自然的統(tǒng)一關(guān)系，并具有多靶點和多成分等特點。因此，從來源廣泛的中藥材中尋找安全有效的天然抑菌劑成為近年來研究的熱點。

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。臨床上常用于“胃陰不足，病后虛熱不退，熱病津傷，骨蒸勞熱，食少干嘔，陰虛火旺，目暗不明，口干煩渴，筋骨痿軟”等癥[4]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛具有抗血栓[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、抗衰老[8]等多種藥理作用[9]。金釵石斛生長于陰暗潮濕的山間林下，在這種微生物豐富自然環(huán)境脅迫下，金釵石斛產(chǎn)生出較強的抵御微生物能力。為此，本文通過對不同極性部位金釵石斛提取物的體外抑制金黃色葡萄球菌等5種耐藥菌的活性評價，比較金釵石斛不同極性部位提取物的抑菌效果，為今后開發(fā)以金釵石斛為原料的天然抑菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯氏菌ATCC700603、大腸桿菌ATCC25922，由遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室提供。

培養(yǎng)基 MH肉湯培養(yǎng)基(青島日水生物技術(shù)有限公司)、瓊脂粉(biosharp)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(上海泰坦科技股份有限公司)、二甲基亞砜(北京綠澤生物技術(shù)有限公司貴州分公司)

金釵石斛藥材采自貴州省赤水市，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院吳發(fā)明副教授鑒定為金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)的莖。

1530酶標(biāo)儀(美國 Thermo 公司)，XFH-50CA電熱式壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，MJX-150生化培養(yǎng)箱(金壇市城東新瑞儀器廠)，VD-650桌上型(垂直送風(fēng))凈化工作臺(上海尚道儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 金釵石斛不同極性部位的制備 稱取干燥的金釵石斛藥材50 g，置2 000 mL圓底燒瓶中，按1∶12的固液比加入蒸餾水，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，靜置冷卻，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏狀，置烘箱干燥，作為水提物(WE)；再稱取金釵石斛藥材200 g，置于5000 mL圓底燒瓶，以1∶12的固液比，加入70%乙醇溶液2 400 mL，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過濾，濃縮至浸膏狀。取一部分浸膏干燥，作為乙醇提取物(EE)；剩余部分用加熱至50 ℃左右的蒸餾水100 mL使其均勻分散，依次用100 mL的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，分別萃取3次[10]，合并萃取液后，經(jīng)減壓濃縮、干燥，得石油醚部位(PE)、乙酸乙酯部位(EAE)和正丁醇部位(BE)提取物，將以上5種金釵石斛提取物分別密封放置于4℃冰箱[11]，備用。

1.2.2 供試液的制備 記錄不同極性部位金釵石斛提取物質(zhì)量，分別精密稱取1.20 g用6.00 mL二甲基亞砜溶液(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，混合均勻，得到200 mg/mL的不同極性部位的金釵石斛供試液。

1.2.3 培養(yǎng)基的配置 MH肉湯培養(yǎng)基：取MH培養(yǎng)基粉末22.00 g，精密稱定，加三蒸水均勻攪拌至充分溶解，定容至500 mL，置121 ℃ 電熱式壓力蒸汽滅菌器中，高壓滅菌30 min，冷卻至室溫，置4 ℃冰箱，密封保存，備用。

MH瓊脂培養(yǎng)基：每100 mL MH液體培養(yǎng)基中加入2～3 g瓊脂粉，置121 ℃ 電熱式壓力蒸汽滅菌器中，高壓滅菌30 min，冷卻至45 ℃倒入瓊脂培養(yǎng)皿平板，凝固后，密封置4 ℃冰箱保存[12]，備用。

1.2.4 菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 實驗前，生物安全柜紫外照射30 min; 將凍存的金黃色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、大腸埃希氏菌(E.coli)、銅綠假單胞菌(PA)、肺炎克雷伯菌(Kleb)復(fù)蘇，采用平板劃線法接種在MH瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h；挑取MH瓊脂培養(yǎng)基上單個菌落于裝有適量MH肉湯培養(yǎng)基的離心管中37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)8 h至菌液渾濁；分別取0、50、100、150、200、250、300、350 μL菌液，用MH肉湯培養(yǎng)基定容至1 000 μL，混勻后用酶標(biāo)儀在600 nm處測定光密度(OD)；將系列不同濃度菌懸液進(jìn)行10倍稀釋，取10-6稀釋液0.1 mL置于瓊脂培養(yǎng)皿，均勻涂布，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，統(tǒng)計培養(yǎng)皿上菌落數(shù)，平行重復(fù)3次，計算均值，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)菌落數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制各個耐藥菌標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

1.2.5 菌液制備 參考文獻(xiàn)[13]方法，菌種復(fù)蘇后劃線接種于MH瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)分別挑取MH瓊脂培養(yǎng)基上單個菌落于適量 MH肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下，振蕩至菌液渾濁。分別吸取各個菌懸液200 μL于96孔無菌培養(yǎng)板內(nèi)，迅速放置酶標(biāo)儀中,600 nm波長處測定各培養(yǎng)孔OD值。根據(jù)測得的OD值代入標(biāo)曲，計算得到菌落數(shù)，稀釋細(xì)菌濃度至5×104cfu/mL，即為實驗菌懸液。

1.2.6 最小抑菌濃度的測定 參考Carla Araya-Cloutier等[14]報道的方法，采用二倍微孔稀釋法，測定不同極性部位金釵石斛提取物對SA、MRSA、PA、Kleb、E.coli五種供試菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。將制備好的供試藥液依次取1 mL加入1 mL無菌水系列倍比稀釋，得不同濃度的系列樣品溶液[10]。取菌懸液,稀釋至濃度約為3×105cfu/mL,接種于96孔無菌培養(yǎng)板內(nèi)。第1-5列每孔均加入180 μL菌懸液和20 μL供試藥液,第6列每孔加入MH肉湯培養(yǎng)基,第7列每孔加入200 μL菌懸液；另取50 μL供試藥液同法操作。均置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后,觀察渾濁程度。部分供試液存在顏色，吸取菌懸液和供試藥液，均勻涂布到瓊脂平板培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h，鑒定實驗結(jié)果。觀察菌落生長情況，以不生長菌落的最高藥物稀釋濃度為藥物的最小抑菌濃度(MIC)。平行3次試驗，以3次結(jié)果相近為標(biāo)準(zhǔn)[15]。

1.2.7 抑菌活性測定 在已紫外30 min的生物安全柜中，將濾紙片(直徑6 mm)分別浸泡于藥液中4～5 h，吸取濃度約為5×105cfu/mL的菌懸液100 μL均勻涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基上，將供試藥液濾紙片和空白濾紙片(DMSO溶液浸泡)分別貼在瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的大小[16]。

2 結(jié)果

2.1 菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線 五種耐藥菌株的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示。

表1 耐藥菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.2 最低抑菌濃度 通過二倍微孔稀釋法對五種提取物進(jìn)行最低抑菌濃度測定，選取了臨床常見的兩種革蘭氏陽性菌(SA、MRSA)和三種革蘭氏陰性菌(PA、Kleb、E.coli)作為試驗菌株。如表2所示，在五種提取物中，EAE表現(xiàn)出最強的抗菌活性，它能較為明顯抑制5種菌株的生長，并且明顯抑制SA、MRSA、PA的生長，最低抑菌濃度為10 mg/mL；EE對SA的抑菌活性也較強，MIC值為10 mg/mL；PE部位除對MRSA有較強抑菌活性外，對其它菌株敏感性均較低；5個不同極性部位對SA、MRSA、PA的抑制作用趨于一致，而對E.coli和Kleb的抑制作用均較弱。以上結(jié)果表明，對金黃色葡萄球菌起抑制效果的成分主要存在于EAE和EE部位，對MRSA和PA起抑制效果的成分主要存在于EAE部位，MIC值均為10 mg/mL。

表2 不同極性部位金釵石斛提取物最低抑菌濃度(MIC)的測定結(jié)果

2.3 抑菌活性 采用紙片擴散法對5種提取物進(jìn)行抗菌活性測定[17]，結(jié)果如表3所示，5種提取物對MRSA的抑菌效果均較好，抑菌圈直徑分別為BE(12.25±1.65)mm、PE(17.25±1.25)mm、EAE(15.75±0.48)mm、EE(11±0.63)mm、WE(13±0.82)mm，說明石油醚萃取部位的效果最好，正丁醇萃取部位和乙醇提取部位對PA、水部位對E.coli均無抑菌圈，說明抑菌活性不明顯。

表3 不同極性部位金釵石斛提取物的抑菌活性

3 討論

中藥以其多成分、多靶點的作用特點及不良反應(yīng)少、無耐藥性、價格低廉等優(yōu)點越來越多的受到國內(nèi)外學(xué)者的重視[18]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為金釵石斛性微寒，味甘，歸胃、腎經(jīng)，用于食少干嘔，熱病傷津，病后虛熱，淺表性胃炎，滋陰降火，口干煩渴，慢性結(jié)腸炎等一系列病癥，目前對于金釵石斛的研究主要集中于其化學(xué)成分及其抗阿爾茲海默癥、抗腫瘤等藥理作用[19]，而對金釵石斛的抗菌活性研究報道較為少見。

在本研究中，首先采用水提法和醇提法得到水提物和乙醇提取物，并將一部分乙醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取得到不同極性部位的金釵石斛提取物，通過二倍微孔稀釋法和濾紙片擴散法比較考察了不同極性部位金釵石斛提取物對5種常見耐藥菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，金釵石斛乙酸乙酯部位(EAE)表現(xiàn)出對5種菌株均有顯著抑菌活性，而水提取部位的抑菌效果均較差，尤其是對大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌幾乎沒有抑制作用。

在觀察5種不同極性部位金釵石斛提取物抑菌效果時，用DMSO溶解后提取物本身存在一定顏色，或有渾濁現(xiàn)象，可能造成一定的誤差，從而影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此采用二倍微孔稀釋法與瓊脂平板法相結(jié)合來評價其最低抑菌濃度[20]。

對比不同極性部位金釵石斛提取物的抑菌作用發(fā)現(xiàn)，EAE的抑菌作用最強，其次是BE和EE，PE除對MRSA具有一定的抑制作用外，對其他菌種抑制作用不明顯，而WE的抑菌作用最差。因此，5種提取物的抑制活性依次為EAE>EE>BE>PE>WE。與王亞萍等[21]報道的金釵石斛醇提物的抑菌效果顯著，而水提物幾乎沒有抑菌性或抑菌性較弱的結(jié)果基本一致。紙片擴散法研究結(jié)果表明，5種提取物對MRSA均有較強的抑菌作用，PE的抑菌直徑為(17.25±1.25)mm，但對其余4種菌株的抑菌效果差；EAE對MRSA的抑菌圈直徑為(15.75±0.48)mm，且對其余4種菌株也有一定抑制作用，其抑菌圈直徑依次為MRSA> Kleb> E.coli> PA> SA。以上結(jié)果表明，金釵石斛中對SA具有抑制作用的成分主要存在于EAE和EE部位,對MRSA和PA起抑制作用的成分主要也在EAE部位，5種提取物對Kleb和E.coli 抑菌作用均較差。有文獻(xiàn)報道金釵石斛的多糖類成分具有一定抑菌作用[15]，而多糖類成分主要集中于水提取物，但是本研究結(jié)果顯示金釵石斛水提物抑菌活性最弱，而其乙酸乙酯部位抑菌作用最強，根據(jù)已有報道金釵石斛化學(xué)成分的極性判斷，金釵石斛中主要發(fā)揮抑菌作用的化學(xué)成分可能為能夠富集于乙酸乙酯部位的生物堿、菲類、聯(lián)芐類成分。

綜上所述，金釵石斛乙酸乙酯部位(EAE)具有較強的抑菌活性，且對革蘭氏陽性菌的抑菌活性優(yōu)于革蘭氏陰性菌，可以為今后金釵石斛抑菌制劑的開發(fā)提供參考。

致謝：感謝遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室周紅教授、黃雅思教授提供本文實驗菌種，并給予實驗指導(dǎo)。