丙泊酚對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及Nrf2/ARE通路的影響

張文杰， 王祥， 徐曉麗， 鄭荇月

(海安市人民醫(yī)院麻醉科，江蘇省海安市226600)

前列腺癌為前列腺上皮惡性細(xì)胞腫瘤，前列腺癌變是一個(gè)多步驟的過程，包括啟動(dòng)、促進(jìn)和進(jìn)展，基因改變的積累導(dǎo)致啟動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌前細(xì)胞群，最終形成具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤[1]。癌癥患者術(shù)后需服用抗癌藥物和放射治療以防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而抗癌藥物通常貴且不良反應(yīng)多，因此迫切需要新的經(jīng)濟(jì)高效的抗癌藥物。丙泊酚是一種臨床上常用的靜脈麻醉藥物，有研究表明，丙泊酚可有效抑制子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和遷移[2-3]。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)參與致癌物解毒的抗氧化酶和抗氧化劑與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythtoid 2 related factor 2，Nrf2)通過激活位于編碼這些酶的啟動(dòng)子區(qū)基因的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)參與氧化應(yīng)激的調(diào)控[4]。因此，本研究分析丙泊酚對(duì)前列腺癌細(xì)胞(prostate cancer cell 3，PC3)增殖、侵襲和凋亡及Nrf2/ARE通路的影響，為前列腺癌的臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 試藥和儀器

丙泊酚購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物有限公司；FITC凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sun-Shine公司；Nrf2、ARE蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；二抗(山羊抗兔)購(gòu)于武漢三鷹生物有限公司。5320R4℃離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)徠卡公司；伯樂Mini-PRO TEAN電泳儀購(gòu)于美國(guó)伯樂公司；LAS 4000成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司；BD FACSCanto II 流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

前列腺癌PC3細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。復(fù)蘇后的細(xì)胞置于1640培養(yǎng)基5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞覆蓋70%時(shí)，加入胰蛋白酶，進(jìn)行細(xì)胞傳代。按照處理因素將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(0 mg/L)、丙泊酚低劑量組(2 mg/L)、丙泊酚中劑量組(4 mg/L)、丙泊酚高劑量組(6 mg/L)和陽(yáng)性對(duì)照組(75 nmol/L阿霉素)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入1 mL胰蛋白酶吹打2 min，2 000 r/min離心10 min,倒掉上清液，加入1 mL 1640培養(yǎng)基，輕微吹打細(xì)胞使細(xì)胞充分懸浮，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到96孔板中培養(yǎng)24 h棄培養(yǎng)基，每孔加入新1640培養(yǎng)基和各組不同處理因素，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)液。每孔加入100 μL培養(yǎng)液和10 μL CCK-8溶液，持續(xù)培養(yǎng)3 h，使用Bio-Rad微孔板閱讀器讀取450 nm處光密度，重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 改良Matrigel Boyden室法測(cè)定細(xì)胞侵襲性

將各組細(xì)胞接種到有基質(zhì)膠的濾膜上，下室放入10%FBS作為趨化劑。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出濾膜，并進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下每個(gè)濾膜隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，重復(fù)3次取平均值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

使用FITC凋亡試劑盒流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。將細(xì)胞洗滌2次，用1×結(jié)合緩沖液1×106個(gè)/mL細(xì)胞懸浮于400 μL FITC溶液中，黑暗中室溫孵育15 min，然后加入染色液(10 μL)，4 ℃避光孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞，重復(fù)3次。

1.6 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液和100 μL蛋白酶K溶液，使細(xì)胞懸浮，超聲細(xì)胞破碎儀作用2 min破碎細(xì)胞，3 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜和封閉后用特異性抗體Nrf2、ARE和肌動(dòng)蛋白(β-actin)4 ℃孵育12 h，孵育后的條帶清洗3次(1%吐溫)，二抗孵育2 h，觀察結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 丙泊酚對(duì)細(xì)胞存活率、侵襲力和凋亡率的影響

與空白對(duì)照組比較，丙泊酚組和陽(yáng)性對(duì)照組PC3細(xì)胞存活率、侵襲力均顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，且效應(yīng)呈丙泊酚劑量依賴性(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，丙泊酚低劑量組和中劑量組PC3細(xì)胞存活率、侵襲力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，而丙泊酚高劑量組差異無(wú)顯著性(P>0.05；表1)。

2.2 丙泊酚對(duì)細(xì)胞Nrf2、ARE蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和丙泊酚組Nrf2、ARE蛋白表達(dá)水平顯著降低，且呈丙泊酚劑量依賴性(P<0.05)；丙泊酚高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組阿霉素作用效果相似(P>0.05；圖1和表2)。

表2 丙泊酚對(duì)PC3細(xì)胞Nrf2、ARE蛋白表達(dá)的影響

圖1 不同劑量丙泊酚作用后前列腺癌PC3細(xì)胞蛋白印跡圖1為空白對(duì)照組；2為丙泊酚低劑量組；3為丙泊酚中劑量組；4為丙泊酚高劑量組；5為陽(yáng)性對(duì)照組。

3 討 論

前列腺癌是最常見的惡性腫瘤，也是發(fā)達(dá)國(guó)家男性癌癥死亡的第二大原因[5]。前列腺癌病程進(jìn)展緩慢，早期無(wú)明顯的臨床癥狀，因此患者容易錯(cuò)過早期的最佳治療時(shí)間，當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生迅速增殖和擴(kuò)散，導(dǎo)致患者出現(xiàn)排尿異常等一系列臨床癥狀時(shí)，往往已經(jīng)到了疾病晚期，使得病情加重[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年前列腺癌全年全球近130萬(wàn)新增病例，占男性惡性腫瘤發(fā)病率的13.5%，位居第二[7]。因此了解和評(píng)價(jià)其具體作用機(jī)制，尋找有效的、新的檢測(cè)方法來(lái)提高前列腺癌早期發(fā)現(xiàn)率、預(yù)后預(yù)測(cè)及個(gè)性化治療是一個(gè)迫切的問題。丙泊酚是一種全身鎮(zhèn)靜催眠藥，廣泛應(yīng)用于全身麻醉的誘導(dǎo)和維持。越來(lái)越多的證據(jù)表明丙泊酚有幾種非麻醉作用，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚具有抑制癌細(xì)胞增殖、黏附、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等潛在的抗癌作用[8]。有研究報(bào)道，丙泊酚可通過降低經(jīng)脂多糖處理的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中HIF-1的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞侵襲和逆轉(zhuǎn)。此外，丙泊酚可抑制肺癌、胰腺癌和宮頸癌細(xì)胞的生存能力并誘導(dǎo)其凋亡[9]。本研究檢測(cè)了不同劑量梯度的丙泊酚對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)丙泊酚可明顯影響前列腺癌PC3細(xì)胞增殖和侵襲能力，并且隨著丙泊酚干預(yù)劑量的增加，其對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞增殖和侵襲的抑制效果越明顯，表明丙泊酚可有效緩解前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖速度，同時(shí)通過抑制其侵襲能力以達(dá)到阻止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的可能。同時(shí)本研究通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)了丙泊酚對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可增加細(xì)胞凋亡率，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明了丙泊酚對(duì)前列腺癌的抑制作用，通過增加其細(xì)胞凋亡率以達(dá)到緩解疾病進(jìn)程的目的。

在臨床實(shí)踐中，常靜脈給予丙泊酚，因其起效短、恢復(fù)快而被廣泛應(yīng)用于各種手術(shù)中,近年來(lái)，其抗腫瘤作用已成為研究熱點(diǎn)[10]。多項(xiàng)研究表明，丙泊酚具有抗氧化作用，主要作用于線粒體復(fù)合物I，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。Nrf2/ARE信號(hào)通路與機(jī)體氧化應(yīng)激密切相關(guān)，Nrf2是機(jī)體中維持細(xì)胞氧化還原平衡的關(guān)鍵翻譯因子[11]。Nrf2/ARE信號(hào)通路的異常高表達(dá)在多種癌癥的轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用[12]。Nrf2表達(dá)的增加，可誘導(dǎo)其下游基因磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1和血紅素氧化酶-1的表達(dá)，造成機(jī)體氧化應(yīng)激進(jìn)一步加重，從而反向調(diào)控受體ARE的表達(dá)，機(jī)體的異常氧化應(yīng)激反應(yīng)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和遷移活性增加，從而導(dǎo)致疾病加重[13]。因此，本文檢測(cè)了Nrf2和其下游ARE蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在未對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞進(jìn)行任何處理時(shí)，Nrf2和ARE蛋白均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)給予丙泊酚干預(yù)后，Nrf2和ARE表達(dá)均下調(diào)，且具有明顯劑量依賴性，表明丙泊酚可能通過調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號(hào)通路來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少細(xì)胞氧化應(yīng)激因子的表達(dá)，從而抑制前列腺癌PC3細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明丙泊酚可有效抑制前列腺癌PC3細(xì)胞增殖與侵襲，并促進(jìn)其凋亡，其作用效果與丙泊酚的劑量密切相關(guān)。此外，本研究結(jié)果表明丙泊酚的抑制增殖與侵襲以及促凋亡的作用，可能與通過調(diào)控細(xì)胞Nrf2/ARE信號(hào)通路來(lái)抑制其氧化應(yīng)激有關(guān)，其具體作用機(jī)制后續(xù)將深入探究，以期為臨床上前列腺癌的治療提供新的方向和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。