毛果楊ZHD家族全基因組水平鑒定及在干旱脅迫下的表達分析

陳雪冰，劉 聰，程 赫，姜廷波，夏德安，魏志剛

（1. 東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150000；2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院 國家林業(yè)和草原局鹽堿地研究中心，北京 100091）

植物在生長發(fā)育過程中會通過不斷調(diào)整基因的表達來適應(yīng)各種逆境，而轉(zhuǎn)錄因子(TFs)是其調(diào)控過程的關(guān)鍵因子[1]。研究表明：鋅指同源結(jié)構(gòu)域(ZF-HD)轉(zhuǎn)錄因子作為一種同源異形盒(HB)蛋白在調(diào)控植物生長發(fā)育以及響應(yīng)多種生物和非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用[2-3]。ZF-HD不僅具有同源結(jié)構(gòu)域(HD)，還包括1個高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域(ZF)[4]，ZF是由2對保守的半胱氨酸(Cys)和/或組氨酸(His)殘基結(jié)合單個鋅離子組成的指環(huán)狀結(jié)構(gòu)蛋白，可特異性與DNA/RNA序列結(jié)合，并參與蛋白質(zhì)互作[2，5]；HD是1個約60個氨基酸的DNA結(jié)合域(DBD)，這段序列折疊成一個識別螺旋附著在DNA的大溝上，特異性地結(jié)合DNA來激活或抑制靶基因的表達[6]。為了方便研究該家族的進化史，HU等[7]將ZFHD重新命名為ZHD。

ZHD蛋白可分ZHD和小鋅指(MIF)兩類，兩者都含有ZF結(jié)構(gòu)域，但MIF缺少HD結(jié)構(gòu)域[8]。2001年ZHD首次在黃花菊Flaveria trinervia中被鑒定出來[9]，隨后擬南芥Arabidopsis thaliana[10]、水稻Oryza sativa[11]、葡萄 Vitis vinifera[8]、大白菜 Brassica rapa ssp. pekinensis[2]、番茄 Solanum lycopersicum[3]、茶樹Camellia sinensis[5]和黃瓜Cucumis sativus[12]等的ZHD被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。研究表明：ZHD能夠調(diào)控植物的抗逆性，如過表達AtZHD1可以提高擬南芥的耐旱性[13]；OsZHD1基因過表達導(dǎo)致水稻葉片卷曲下垂，降低水稻的耐旱性[14]；在大豆Glycine max中，過表達GmZF-HD1和GmZF-HD2會與編碼鈣調(diào)蛋白的GmGaM4基因啟動子結(jié)合增強大豆的抗病能力[15]；TaZFHD1參與小麥Triticum aestivum生長發(fā)育過程中茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)和乙烯(ET)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，調(diào)節(jié)小麥對脅迫的抗性[16]；大白菜中的BraZF-HD受光、低溫等非生物脅迫誘導(dǎo)表達[2]；此外，水稻ZHDs與OsDREB1B基因的啟動子結(jié)合調(diào)節(jié)水稻對低溫、干旱和機械損傷的抗性[17]。ZHD廣泛存在于植物中，在植物對環(huán)境脅迫響應(yīng)過程中起著重要的作用。

毛果楊Populus trichocarpa是研究木本植物生長發(fā)育、材質(zhì)材性以及抗逆性狀的重要模式植物，但是目前毛果楊ZHD (PtrZHD)家族及非生物脅迫響應(yīng)特性的研究尚無報道。本研究通過生物信息學(xué)手段鑒定了毛果楊全基因組內(nèi)的PtrZHDs基因，并對其編碼蛋白特征、系統(tǒng)發(fā)育、基因擴張、基因結(jié)構(gòu)與保守基序、啟動子順式作用元件和表達特性進行分析，為研究該家族基因的功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

將來自中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心的野生型毛果楊‘Nisqually-1’通過組織培養(yǎng)擴繁后，選取長勢一致的4周齡組培苗隨機分成6組，用質(zhì)量分數(shù)為8%的聚乙二醇(PEG 6 000，來自邢臺鑫藍星科技有限公司)水溶液處理0、3、12、24、48和72 h，分別采集各處理組植株的根、莖和葉部組織，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，每組處理重復(fù)3次。

1.2 PtrZHD家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

利用擬南芥ZHD家族成員的氨基酸序列比對Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)網(wǎng)站中毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫獲得候選序列，將得到的序列上傳到Pfam (http://pfam.xfam.org/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)數(shù)據(jù)庫，去除不含ZF-HD_dimer (PF04770)結(jié)構(gòu)域的序列得到全部的PtrZHDs[12]。從Phytozome數(shù)據(jù)庫中獲取PtrZHD家族基因的染色體位置、基因序列以及開放閱讀框長度等信息，并根據(jù)基因所在染色體號及位置對其進行命名。在ExPasy (https://web.expasy.org/protparam/)網(wǎng)站預(yù)測PtrZHD家族分子質(zhì)量、等電點和氨基酸序列長度。

1.3 PtrZHD 家族系統(tǒng)發(fā)育分析

將鑒定出的毛果楊ZHD氨基酸序列與已知的擬南芥[10]、水稻[11]和大白菜[2]的ZHD氨基酸序列在MEGA X軟件的ClustaW程序中進行多重序列比對，采用鄰近法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，步長設(shè)為10 000次，得到系統(tǒng)發(fā)育進化樹數(shù)據(jù)[18]，經(jīng)EvolView(https://www.evolgenius.info/ evolview/)網(wǎng)站可視化。

1.4 PtrZHD家族同源基因的同義替換率(Ks)和非同義替換率(Ka)分析

將PtrZHD家族基因的蛋白質(zhì)編碼序列(CDs)在美國國家生物信息中心(NCBI)網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行BLAST比對，以超過300 bp且同源性超過80%為標(biāo)準(zhǔn)鑒定同源基因?qū)19]，同源關(guān)系經(jīng)TBtools[20]軟件可視化。利用TBtools計算同源基因的Ks、Ka以及Ka/Ks[20-21]。

1.5 PtrZHD家族結(jié)構(gòu)及保守型基序分析

從毛果楊數(shù)據(jù)庫(https://genome.jgi.doe.gov/portal/pages/dynamicOrganismDownload.jsf?organism=Ptrichocarpa)獲得PtrZHD外顯子和內(nèi)含子長度及位置信息，并通過TBtools軟件可視化。使用MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)網(wǎng)站對PtrZHD家族進行保守基序分析，保守域數(shù)目設(shè)置為15，結(jié)果由TBtools軟件可視化。

1.6 PtrZHD家族啟動子區(qū)順式作用元件分析

利用TBtools軟件從毛果楊基因組數(shù)據(jù)中提取PtrZHD家族起始密碼子前2 000 bp的序列作為啟動子區(qū)域，上傳至PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)網(wǎng)站進行順式作用元件分析[22]，獲得的數(shù)據(jù)通過TBtools軟件可視化。

1.7 PtrZHD家族表達特性分析

1.7.1 組織表達特異性 將野生型毛果楊通過組織培養(yǎng)擴繁后，挑選長勢一致的4周齡組培苗，分別采集根、莖和葉組織，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于實時熒光定量PCR (qRT-PCR)分析。每組處理重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法計算相對表達量，并通過TBtools軟件可視化。

1.7.2 干旱脅迫下的響應(yīng)特性 將長勢一致的1月齡組培苗隨機分成6組。用質(zhì)量分數(shù)為8%的PEG 6000處理0、6、12、24、48和72 h。分別采集各處理組植株的根、莖和葉組織，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行qRT-PCR分析。每組處理重復(fù)3次，采用 2-ΔΔCt法計算相對表達量，并通過TBtools軟件可視化。

1.7.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR分析 利用植物總RNA試劑盒(TSP412，北京擎科生物科技有限公司)提取總 RNA，然后采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit [Perfect Real Time，寶生物工程 (大連)有限公司] 試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA，獲得cDNA后進行qRT-PCR分析。將PtrZHD家族蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列上傳至上海生工定量引物設(shè)計網(wǎng)站(https://www.sangon.com/new PrimerDesign)設(shè)計定量引物，以PtrActin為內(nèi)參基因[19]。在賽默飛 ABI 7 500 熒光定量 PCR 儀上進行試驗，體系如下：2×TransStart TOP/Tip Green qPCR Super mix 10 μL、定量引物上下游混合引物 (10 μmol·L-1) 0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference DyeⅡ(50×) 0.4 μL，加去離子水補充至 20 μL 體系。反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性 30 s；94 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 35 s，40 次循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrZHD家族成員的鑒定及編碼蛋白的基本特征

將所有含ZF-HD_dimer (PF04770)結(jié)構(gòu)域的序列上傳到Pfam和SMART數(shù)據(jù)庫，去除冗余序列后從毛果楊基因組中鑒定出21個PtrZHD (表1)，根據(jù)基因所在染色體及染色體上的位置信息，將它們分別命名為PtrZHD1～PtrZHD21。PtrZHD家族基因編碼蛋白的基本特征分析表明：各PtrZHD所編碼蛋白的長度為 73～339 個、分子量為 8.28～37.98 kDa、等電點為 6.39～9.31、編碼序列長度為 222～1 020 bp，蛋白長度、分子量、等電點和編碼序列長度差異明顯。表明PtrZHD家族基因及其編碼蛋白特征存在較大差異，即該家族各個成員的生物學(xué)功能發(fā)生了分化。

表1 毛果楊 ZHD家族基因概況Table 1 Overview of ZHD gene family in P. trichocarpa

2.2 PtrZHD 家族的進化

利用雙子葉植物(擬南芥、毛果楊和大白菜)與單子葉植物(水稻)的ZHD蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖 1)，PtrZHD 家族分為 2 個種類 (ZHD 和 MIF)，這 2 個種類可以分成 7 個亞族 (Ⅰ～Ⅶ)[5，8，12]，PtrZHD不同亞族中即包括單子葉植物又包括雙子葉植物，表明該基因家族的分化早于單雙子葉植物的分化。

圖1 毛果楊、擬南芥、水稻和大白菜ZHD家族系統(tǒng)進化樹Figure 1 Phylogenetic tree of ZHD protein family in P. trichocarpa， A. thaliana ， O. sativa and B. rapa ssp. pekinensis

2.3 PtrZHD家族的擴張

PtrZHD家族成員在毛果楊染色體上的分布(圖2)顯示：21個PtrZHD不均勻地分布在毛果楊12條染色體上；4、5號染色體上分別分布4和3個ZHD，2、3、17和19號染色體上各分布2個ZHD，7、8、10、12、13和15號染色體上只分布1個ZHD，1、6、9、11、14、16和18號染色體上無ZHD分布。PtrZHD家族編碼序列Blast結(jié)果表明：PtrZHD1和PtrZHD11、PtrZHD2和PtrZHD10、PtrZHD3和PtrZHD8、PtrZHD5和PtrZHD19、PtrZHD6和PtrZHD18、PtrZHD9和PtrZHD12、PtrZHD13和PtrZHD14以及PtrZHD15和PtrZHD17有共線性關(guān)系(圖2和表2)，同源片段長度大于300 bp且同源性超過80%，是進化過程中由于全基因組復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制而形成的同源基因[3，22]，表明PtrZHD可能通過全基因組復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制進行家族擴張。8對同源基因的Ka/Ks均小于1(表2)，說明PtrZHD家族在進化過程中經(jīng)歷了純化選擇，留存的基因較為保守[3]。

圖2 PtrZHD 家族基因染色體定位及同源性分析Figure 2 Chromosome localization and homology analysis of PtrZHD gene

表2 同源基因的 Ka/Ks 及同源性Table 2 Ka/Ks values and homologous status of homologous genes

2.4 PtrZHD家族基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白保守基序

PtrZHD家族21個成員中有11個成員含有內(nèi)含子(圖3B)，這與之前報道的其他物種ZHD家族中有內(nèi)含子的成員數(shù)量較少的研究結(jié)果稍有不同[5，12]。PtrZHD蛋白具有2個保守性較高的基序：同源結(jié)構(gòu)域序列 (Motif 1)和鋅指結(jié)構(gòu)域序列 (Motif 2)(圖 3C)。Motif 2 與 DNA 的特異性結(jié)合有關(guān)；Motif 1 與蛋白二聚體的形成有關(guān)[7]。所有的PtrZHD蛋白都具有Motif 1，而且除了PtrZHD4和亞族Ⅴ(MIF)的成員之外，其他家族成員都含Motif 2，說明該家族成員在進化過程中比較保守。

圖3 PtrZHD 家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析Figure 3 Analysis of gene structure and protein conserved motif of PtrZHD gene

2.5 PtrZHD家族啟動子區(qū)順式作用元件

PtrZHD家族啟動子區(qū)順式作用元件可分為2個大類(圖4)：第一大類為植物激素響應(yīng)元件，共有5種，分別為生長素響應(yīng)元件(AuxRR-core、TGA-element)，水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTC-motif、TGACG-motif)，脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)和赤霉素響應(yīng)元件(P-box、GARE-motif)；第二大類為非生物脅迫響應(yīng)元件，共有4種，分別為厭氧誘導(dǎo)元件(ARE)、干旱誘導(dǎo)性結(jié)合位點(MBS)、抗病和脅迫誘導(dǎo)元件(TC-rich repeats)和低溫響應(yīng)元件(LTR)。PtrZHD家族各基因啟動子區(qū)存在不同類型的作用元件，但處于同一亞族的各基因含有相似的作用元件(圖4)，亞族Ⅰ主要包含茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件和厭氧誘導(dǎo)元件；亞族Ⅱ主要包含水楊酸響應(yīng)元件和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件；亞族Ⅲ主要包含厭氧誘導(dǎo)元件、MYB干旱誘導(dǎo)性結(jié)合位點以及抗病和脅迫誘導(dǎo)元件；亞族Ⅳ主要包含生長素響應(yīng)元件，水楊酸響應(yīng)元件，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，脫落酸響應(yīng)元件和厭氧誘導(dǎo)元件；亞族Ⅴ主要包含水楊酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件和MYB干旱誘導(dǎo)性結(jié)合位點；亞族Ⅵ主要包含茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、MYB干旱誘導(dǎo)性結(jié)合位點和低溫響應(yīng)元件；亞族Ⅶ主要包含水楊酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件和厭氧誘導(dǎo)元件。以上結(jié)果說明：PtrZHD家族可能對植物激素和逆境脅迫有響應(yīng)能力，雖然不同基因之間響應(yīng)元件種類存在差異，但是同一亞族基因啟動子區(qū)順式作用元件種類基本相同。

圖4 PtrZHD 家族基因啟動子區(qū)順式作用元件分析Figure 4 Analysis of cis-acting elements in promoter region of PtrZHD gene

2.6 PtrZHD家族組織表達與干旱脅迫響應(yīng)特征

為了了解ZHD在毛果楊生長發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)中的潛在功能，利用qRT-PCR對毛果楊ZHD家族成員在根、莖和葉組織中的表達模式進行分析。結(jié)果(圖5)表明：毛果楊21個PtrZHDs中有1、7和13個分別在根、莖和葉部組織偏好表達。亞族Ⅰ和Ⅲ的成員主要在葉中高表達；亞族Ⅱ和Ⅳ的成員全都在葉中高表達；亞族Ⅴ成員主要在莖中高表達；亞族Ⅵ成員主要在莖和葉中高表達；亞族Ⅶ成員在莖中高表達。毛果楊ZHD家族成員在根、莖和葉中有不同的表達特性，但同一亞族各成員偏好表達部位基本相同，說明ZHD在毛果楊根、莖和葉部組織中的生物學(xué)功能產(chǎn)生了分化，但同一亞族各成員功能相似。

圖5 PtrZHDs 組織表達特異性分析Figure 5 Analysis of tissue expression specificity of PtrZHDs gene

從圖6可知：在根中，隨著干旱脅迫時間的增加，部分PtrZHD的表達量顯著上調(diào)，達到峰值后逐漸降低，PtrZHD3、PtrZHD8、PtrZHD9、PtrZHD10、PtrZHD11、PtrZHD5、PtrZHD13和PtrZHD14在干旱脅迫下表達量呈持續(xù)上升趨勢，PtrZHD1、PtrZHD6在干旱脅迫下表達量下降；在莖中，大部分PtrZHD在干旱脅迫后顯著上調(diào)表達，達到峰值后逐漸降低，而PtrZHD2、PtrZHD3、PtrZHD5、PtrZHD6和PtrZHD7在干旱脅迫下表達量呈持續(xù)上升趨勢；在葉中，大部分PtrZHD在干旱脅迫后表達量同樣呈先升后降的趨勢，PtrZHD5、PtrZHD7和PtrZHD20在干旱脅迫下表達量持續(xù)下降，而PtrZHD1和PtrZHD18在干旱脅迫下表達量呈持續(xù)上升趨勢。從響應(yīng)速度來看，根中大部分PtrZHD基因響應(yīng)干旱脅迫的快速上升期發(fā)生在6、12或72 h，而在莖和葉中的快速上升期發(fā)生在6或12 h。表明毛果楊ZHD家族各成員響應(yīng)干旱脅迫且在脅迫中發(fā)揮不同的作用。

圖6 不同組織中 PtrZHDs 在干旱脅迫下的表達譜分析Figure 6 Expression profile analysis of PtrZHDs gene in different tissues under drought stress

3 討論

ZHD是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中起著重要作用[6，15]。本研究從全基因水平鑒定出21個PtrZHDs家族成員，進化分析表明(圖1)：21個PtrZHDs可以分為2個不同的種類(ZHD和MIF)、7個亞族(Ⅰ～Ⅶ)，這與葡萄[8]、茶樹[5]和黃瓜[12]中的分類基本一致。

PtrZHD家族有76%的成員涉及全基因組復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制現(xiàn)象，說明該基因家族擴張的主要方式是全基因組復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制[22-23]，基因復(fù)制可以提供豐富的遺傳物質(zhì)有助于毛果楊適應(yīng)外界環(huán)境。PtrZHD家族同源基因的Ka/Ks均小于1，表明純化作用在該基因家族進化過程中存在一定的選擇壓力[3]，說明PtrZHD家族基因具有較強的保守性。同時，PtrZHD家族基因編碼蛋白保守基序分析發(fā)現(xiàn)：21個PtrZHD蛋白具有2個保守性較高的基序Motif 1和Motif 2，進一步說明PtrZHD家族在進化過程中較為保守。

啟動子分析發(fā)現(xiàn)：雖然PtrZHD家族啟動子區(qū)順式作用元件的種類不同，但處于同一亞族基因啟動子區(qū)順式作用元件類型基本相同，同時，同一亞族基因編碼蛋白的保守基序也基本相同，表明PtrZHD家族不同亞族的生物學(xué)功能產(chǎn)生了分化，但同一亞族各基因的生物學(xué)功能基本相同；PtrZHD家族成員在毛果楊根、莖和葉部組織中具有偏好性表達特征，但同一亞族基因的偏好表達部位基本相同。

毛果楊中具有內(nèi)含子的ZHD占比(52%)多于擬南芥(0%)[2]、水稻(33%)[24]、玉米Zea mays(13%)[24]、黃瓜(38%)[14]、苦蕎麥Fagopyrum tataricum (20%)[25]、大白菜(3%)[2]和番茄(4%)[3]等草本植物，內(nèi)含子增多可以加大轉(zhuǎn)錄本的多樣性，提高生物的抗逆能力[26]。因此，毛果楊ZHD的內(nèi)含子比草本植物多的原因可能是毛果楊生命周期長、生存空間大，需要應(yīng)對更為復(fù)雜的環(huán)境挑戰(zhàn)，所以進化出了更多含有內(nèi)含子的基因以保證其正常生長發(fā)育。

ZHD能夠調(diào)控植物的生長發(fā)育和對干旱脅迫的抗性，如過表達AtZHD1可以提高擬南芥的耐旱性[13]，OsZHD1基因過表達導(dǎo)致水稻葉片卷曲下垂，降低水稻的耐旱性[14]；毛果楊亞族Ⅱ中的PtrZHD2、PtrZHD10與AtZHD1、OsZHD1聚類在一起，且同時在葉部組織中高表達，表明PtrZHD2和PtrZHD10可能通過調(diào)控毛果楊葉片的生長發(fā)育來響應(yīng)干旱脅迫的。生物在遭受脅迫時，基因的相關(guān)順勢作用元件會影響其自身的轉(zhuǎn)錄以響應(yīng)脅迫[27]，PtrZHD家族基因啟動子區(qū)含有MYB干旱誘導(dǎo)性結(jié)合位點，而且PtrZHD家族基因在干旱脅迫下的表達量會隨著脅迫時間的增加而發(fā)生變化，進一步說明在毛果楊干旱脅迫的響應(yīng)中，PtrZHD家族基因發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究在全基因組水平上鑒定出21個PtrZHDs，通過系統(tǒng)發(fā)育將其分為7個亞族；同源性及Ka、Ks分析表明：PtrZHD通過全基因組復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制進行家族擴張且在進化過程中經(jīng)歷了純化選擇；啟動子順式作用元件分析表明：PtrZHD家族基因能夠響應(yīng)干旱脅迫信號；基因結(jié)構(gòu)和基序分析表明：PtrZHD家族基因功能發(fā)生了分化但同一亞族基因生物學(xué)功能基本相同；組織表達特異性和干旱脅迫下的表達模式表明：毛果楊ZHD在不同組織中行使特定的生物學(xué)功能且能夠響應(yīng)干旱脅迫。