迷迭香酸對高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞遷移、凋亡的作用

王化湘， 劉光化， 簡唯求， 彭輝燦， 李姣

(1.隆回縣人民醫(yī)院，湖南省邵陽市 422200；2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院眼科，湖南省衡陽市421001)

糖尿病視網(wǎng)膜病變是目前全世界范圍內(nèi)糖尿病患者最常見的視力損害并發(fā)癥，其發(fā)病機制十分復(fù)雜，主要與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞及新生血管生成有關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者存在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞遷移與凋亡的情況[2]。目前臨床對于糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療主要通過手術(shù)與藥物治療，但由于個體因素的原因，目前的治療方法并不能滿足全部患者的需求，因此國內(nèi)外眾多學(xué)者一直在積極尋找新的治療策略。迷迭香酸是一種水溶性天然酚酸類化合物，目前的藥理學(xué)研究表明其有較強的抗氧化能力與抗炎活性[3]，對于抑制微血管生成同樣具有一定作用[4]，但目前國內(nèi)外關(guān)于迷迭香酸在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡方面的研究未見報道。本研究通過體外實驗用高糖培養(yǎng)構(gòu)建糖尿病視網(wǎng)膜病變的細胞模型，來探討迷迭香酸對人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

迷迭香酸購自武漢華翔科潔生物技術(shù)有限公司；Trizol Reagent總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自美國英杰公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；PCR基因引物購自上海生工生物工程股份有限公司；ELISA試劑盒購于江蘇碧云天有限公司；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)蛋白X(Bcl-2-associated X protein，BAX)、β-actin抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清購自美國GIBCO公司；人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞購自上海中科院細胞庫。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組處理

將解凍后人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移至含1%青霉素、鏈霉素與10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，在5%CO237 ℃恒溫條件下傳代培養(yǎng)。當(dāng)細胞處于對數(shù)生長期時進行后續(xù)試驗。取發(fā)育良好的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞按培養(yǎng)方案分為對照組、迷迭香酸組、高糖組、聯(lián)合組。對照組在正常培養(yǎng)過程中不進行任何干預(yù)，迷迭香酸組在細胞正常培養(yǎng)過程中加入50 μmol/L的迷迭香酸干預(yù)，高糖組在細胞正常培養(yǎng)過程中加入25 mmol/L的高糖培養(yǎng)液進行干預(yù)[5]，聯(lián)合組在細胞正常培養(yǎng)過程中加入25 mmol/L的高糖培養(yǎng)液與50 μmol/L的迷迭香酸進行干預(yù)。

1.3 Transwell試驗

于Transwell小室的上室中加入無血清的DMEM培養(yǎng)基并培養(yǎng)1 h使膜層親水，隨后棄去培養(yǎng)基，上室加入200 μL的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞懸液，隨后按不同分組向下室加入含有不同成分的培養(yǎng)基，每組設(shè)置5組復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中放置過夜。次日分別對下室細胞進行多聚甲醛固定與0.1%結(jié)晶紫染色，室溫放置5 min后觀察各組細胞遷移狀態(tài)。

1.4 流式細胞術(shù)

將培養(yǎng)后的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞懸液1 200 r/min離心5 min后棄去上清液，洗滌2次后通過200目銅篩網(wǎng)過濾細胞，隨后用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒對其進行處理，避光孵育15 min后用流式儀對細胞的凋亡情況進行檢測，并使用流式軟件CytExpert對細胞凋亡結(jié)果進行處理。

1.5 ELISA試驗

收集離心后的上清液，參照ELISA檢測試劑盒說明書測定各組白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量。

1.6 Western blotting試驗

將培養(yǎng)后的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞懸液離心后棄去上清液，然后加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑提取總蛋白，以BCA法測定樣品蛋白的水平，隨后以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液沸水加熱變性。將提取的總蛋白依次進行上樣、SDS-PAGE電泳、5%脫脂奶粉封閉及PVDF膜濕法轉(zhuǎn)膜操作。轉(zhuǎn)膜后分別孵育VEGF、Caspase-3、Bcl-2、BAX及β-actin抗體與相對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗2 h，以凝膠成像系統(tǒng)進行圖形采集，以β-actin為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ圖像分析軟件對各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中各因子的相對表達量進行分析。

1.7 實時熒光定量PCR

將處理后收集到的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞懸液離心后棄去上清液，通過Trizol Reagent總RNA提取試劑盒進行總RNA提取，隨后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒與各細胞因子上下游引物混合離心，隨后于PCR儀上進行擴增，循環(huán)完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號值(Ct值)進行相對定量分析。引物信息(5′-3′)：VEGF上游引物TCGAGACCCTGGTGGACATC，下游引物CACACAGGACGGCTTGAAGA；Caspase-3上游引物GTCCCACTGTCTGTCT CA，下游引物GAATGTCATCTCGCTCTG；Bcl-2上游引物TGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGAC，下游引物CTGACGCACACCTATTGCAAGCAAGGGTTC；BAX上游引物GAGTGGAAGATGTCCGGCTC，下游引物CCAGGAGGAAGAAGGCTTGG；β-actin上游引物TCAGGTCATCACTATCGGCAAT，下游引物AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的遷移能力比較

Transwell結(jié)果顯示，高糖組[(136.5±9.4)個]遷移細胞數(shù)量較對照組[(34.3±3.8)個]顯著增加(P<0.05)，迷迭香酸組[(29.5±1.6)個]較對照組減少，但差異無顯著性(P>0.05)；聯(lián)合組[(54.6±6.7)個]與迷迭香酸組遷移細胞數(shù)量均較高糖組顯著減少(P<0.05；圖1)。

圖1 顯微鏡下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的遷移狀態(tài)(0.1%結(jié)晶紫染色，50×)

2.2 各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡情況比較

流式細胞術(shù)結(jié)果如圖2所示，高糖組細胞凋亡水平(51.50%±9.68%)較對照組(15.84%±3.67%)、迷迭香酸組(17.16%±4.52%)、聯(lián)合組(25.00%±5.24%)顯著增加(P<0.05)。

2.3 各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞炎癥指標(biāo)比較

ELISA結(jié)果顯示，高糖組炎癥指標(biāo)的含量較對照組顯著升高；聯(lián)合組、迷迭香酸組炎癥指標(biāo)的含量較高糖組顯著降低(P<0.05；表1)。

圖2 各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡情況

2.4 各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞VEGF與凋亡基因的蛋白表達水平

Western blotting結(jié)果如圖3所示，與對照組及迷迭香酸組比較，高糖組VEGF、Caspase-3與BAX的蛋白表達量顯著升高，Bcl-2表達量顯著降低(P<0.05)。與高糖組比較，聯(lián)合組及迷迭香酸組細胞中VEGF、Caspase-3與BAX的蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)。

表1 各組細胞炎癥指標(biāo)的水平比較 單位：μg/L

圖3 各組細胞中VEGF、BAX、Caspase-3、Bcl-2蛋白水平a為P<0.05，與對照組及迷迭香酸組比較；b為P<0.05，與高糖組比較。

2.5 各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞VEGF與凋亡基因的mRNA表達水平

qRT-PCR結(jié)果如圖4所示，與對照組及迷迭香酸組比較，高糖組VEGF、Caspase-3與BAX的mRNA表達水平升高，Bcl-2表達水平下降；與高糖組比較，聯(lián)合組及迷迭香酸組VEGF、Caspase-3、BAX的mRNA表達水平下降，Bcl-2的mRNA水平升高(P<0.05)。

圖4 各組細胞中VEGF、Capase-3、BAX、Bcl-2 mRNA表達水平a為P<0.05，與對照組及迷迭香酸組比較；b為P<0.05，與高糖組比較。

3 討 論

隨著社會環(huán)境、人口老齡化與人類飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病的發(fā)病率近年來逐漸上升，目前已成為嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病。研究表明，糖尿病的危害主要是微血管方面的病變[6]，對患者機體多器官造成嚴(yán)重損害，其中對于視力損害最為嚴(yán)重的并發(fā)癥是糖尿病視網(wǎng)膜病變。糖尿病視網(wǎng)膜病變主要表現(xiàn)為眼部微血管的病變，在疾病發(fā)展過程中，人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞會發(fā)生增殖與遷移導(dǎo)致新生血管的生成，同時其氧化-抗氧化系統(tǒng)會出現(xiàn)紊亂，產(chǎn)生大量的活性氧，從而破壞細胞的正常功能，并且機體炎癥指標(biāo)IL-1β、IL-6、TNF-α?xí)^度表達，造成內(nèi)環(huán)境進一步紊亂[7]。如果未能得到及時治療，患者的視力會加速下降直至完全失去。本研究通過培養(yǎng)暴露于高糖環(huán)境的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，模擬糖尿病患者體內(nèi)高血糖狀態(tài)[8]，并給予迷迭香酸進行干預(yù)，以研究迷迭香酸對人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的作用及相關(guān)機制。

目前臨床上糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療方法包括全身給予改善微循環(huán)的藥物治療、玻璃體腔藥物注射、視網(wǎng)膜激光光凝以及玻璃體手術(shù)治療[9-11]。VEGF作為一種在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，其拮抗藥物通過玻璃體注射治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的療效同樣得到了臨床的認(rèn)可，但存在易導(dǎo)致患者出現(xiàn)視網(wǎng)膜纖維化的缺陷[12]。近些年來，中醫(yī)藥在眼科疾病治療方面取得了一定的療效。迷迭香酸是從唇形科植物迷迭香中分離得到的天然水溶性多酚羥基化合物，藥理學(xué)研究表明，其具有多種藥理學(xué)功能，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等等，并得到了國內(nèi)外眾多學(xué)者的認(rèn)可[13]。在本研究中，迷迭香酸能明顯抑制高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的遷移能力，提示迷迭香酸可作為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療藥物。此外，迷迭香酸同樣對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中的炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用，進一步說明了迷迭香酸作為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療藥物具有非常廣闊的應(yīng)用潛力。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是機體內(nèi)細胞死亡的重要途徑[14]，當(dāng)機體正常的凋亡程序受阻時會引發(fā)細胞的過度凋亡，導(dǎo)致相關(guān)疾病的產(chǎn)生[15]。在糖尿病性視網(wǎng)膜病變過程中，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞內(nèi)出現(xiàn)大量炎性介質(zhì)，彼此之間形成級聯(lián)反應(yīng)共同導(dǎo)致細胞非程序性凋亡[16]。國內(nèi)外多項研究均證實了高濃度葡萄糖可增加人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的細胞凋亡水平[17]。本研究結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的凋亡細胞數(shù)量顯著增加，促凋亡基因表達水平上調(diào)，與各研究結(jié)果一致。同時，本研究結(jié)果也顯示，當(dāng)加入迷迭香酸進行干預(yù)時，能夠明顯改善高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的凋亡狀態(tài)，其促凋亡基因表達水平顯著下降，抑凋亡基因顯著上升。

綜上所述，迷迭香酸能夠通過抑制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞遷移與炎癥，從而阻止凋亡進程的發(fā)生，降低細胞凋亡率，發(fā)揮對人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的保護作用，本研究為糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥治療提供了一定的依據(jù)。