食管鱗狀細胞癌癌變過程中HPV16/18 E6蛋白與PIK3CA、PIK3CB突變的相關(guān)性及其臨床意義

溫菲菲，李揚揚，何 雙，許曉陽，崔忠澤，路麗禎，吳淑華

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[1]，患者生存率低[2]，預(yù)后差。目前認為絕大多數(shù)食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)來自鱗狀上皮異型增生的惡變，即正常上皮→低級別異型增生(low-grade intraepithelial neoplasia, LGIN)→高級別異型增生(high-grade intraepithelial neoplasia, HGIN)→ESCC，其中由LGIN和HGIN演變?yōu)榻櫚┑南鄬ξｋU度分別為9.8和28.3[3-4]。病毒感染與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)HPV感染與食管癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。HPV16和HPV18型病毒作為HPV中最常見的類型，主要通過抑制抑癌基因的功能促使細胞癌變[6]。HPV16/18 E6蛋白作為HPV感染后的早期癌蛋白，在HPV感染后病毒復(fù)制和細胞惡變的過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。Ilahi等[9]采用免疫組化法檢測HPV16/18 E6蛋白的表達并應(yīng)用PCR檢測HPV16、18的一致性高達85%。HPV16/18 E6蛋白能夠準確反映HPV16、18病毒在體內(nèi)的活性狀態(tài)。本課題前期實驗發(fā)現(xiàn)，在食管癌中PIK3CA、PIK3CB呈高表達[10]。然而，食管癌中HPV感染與PIK3CA、PIK3CB突變的相關(guān)性及其對食管癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的影響尚缺乏深入研究。本實驗采用免疫組化法檢測HPV16/18 E6蛋白、p53、PIK3CA和PIK3CB在食管正常黏膜、LGIN、HGIN及ESCC中的表達情況，探討HPV16/18 E6蛋白、p53、PIK3CA和PIK3CB在食管癌癌變過程中所發(fā)揮的作用，為進一步分析食管癌的發(fā)生、發(fā)展機制和靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2020年12月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的胃鏡下黏膜下剝離術(shù)(endoscopic dissection, ESD)切除食管LGIN 35例，HGIN 34例。收集2009年1月～2011年12月手術(shù)切除的ESCC 137例，正常食管黏膜(距腫瘤旁≥5 cm)32例。根據(jù)WHO(2019)消化系統(tǒng)腫瘤分類標準[11]，所選病例切片由兩位資深病理專家重新閱片，所有病例均為首次發(fā)現(xiàn)，術(shù)前均未行放、化療。

1.2 試劑鼠抗人PIK3CA(克隆號ab5453)和PIK3CB(克隆號ab5559)抗體均購自Abcam公司；鼠抗人HPV16/18 E6(克隆號C1P5)抗體購自Santa Cruz公司；p53(克隆號DO-7)抗體、通用型二抗及DAB顯色液均購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 采用免疫組化EnVision法染色：將切片脫蠟、水化，3%H2O2孵育30 min，高壓熱修復(fù)抗原，加一抗PIK3CA(1 ∶150)、PIK3CB(1 ∶250)、HPV16/18 E6(1 ∶200)、p53(即用型工作液)4 ℃過夜，加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為空白對照，用已知HPV16/18 E6陽性的子宮頸癌組織切片、已知p53陽性的子宮漿液性癌組織切片、已知PIK3CA蛋白陽性的腦組織切片、已知PI3KCB蛋白陽性的扁桃體組織切片作為陽性對照。

1.3.2結(jié)果判斷 HPV16/18 E6、p53陽性主要位于腫瘤細胞胞核，PIK3CA、PIK3CB陽性主要位于腫瘤細胞胞質(zhì)。采用雙盲法在每張切片上隨機觀察10個高倍視野(400×)。每視野計數(shù)100個腫瘤細胞，根據(jù)細胞染色強度和陽性細胞比例評判實驗結(jié)果。按胞質(zhì)或胞核發(fā)現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞標志。染色強度：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分(染色深淺與背景著色相對比)；陽性細胞百分比：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；將兩項得分相乘作為最終分數(shù)。對于PIK3CA、PIK3CB、HPV16/18 E6蛋白的評分≤4分為陰性，>4分為陽性；對于p53，當(dāng)評分為2～8分時p53的判定為陰性，當(dāng)評分為0～1或9～12分時p53判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，不同分組間蛋白的表達差異及各蛋白表達與臨床病理因素之間的關(guān)系采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法進行單因素生存分析，Log-rank法比較統(tǒng)計學(xué)差異，Cox回歸模型確立影響預(yù)后的獨立因素；不同分組間蛋白之間的表達相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC癌變過程中HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB的表達HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB蛋白在食管正常黏膜組、LGIN組、HGIN組及ESCC組中呈不同程度的陽性(表1，圖1～4)。HPV16/18 E6蛋白在食管正常黏膜組、LGIN組、HGIN組、ESCC組的陽性率分別為0、8.6%、26.5%、29.9%；統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，HPV16/18 E6蛋白在ESCC組與HGIN組中的表達高于食管正常黏膜組和LGIN組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，LGIN組與食管正常黏膜組、HGIN組與ESCC組相比，蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。p53蛋白在食管正常黏膜組、LGIN組、HGIN組、ESCC組中的陽性率分別為9.4%、28.6%、50.0%、68.6%；統(tǒng)計分析顯示，p53蛋白在ESCC組中的表達高于食管正常黏膜組和LGIN組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，p53蛋白在HGIN組中的表達高于食管正常黏膜組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，食管正常黏膜組與LGIN組、HGIN組與ESCC組相比，蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PIK3CA蛋白在食管正常黏膜組、LGIN組、HGIN組和ESCC組中的陽性率分別為9.4%、17.1%、26.5%、25.5%；統(tǒng)計分析顯示，PIK3CA蛋白在ESCC組中的表達高于食管正常黏膜組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而食管正常黏膜組與LGIN組、HGIN組，ESCC組與LGIN組、HGIN組，兩兩相比，蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。PIK3CB蛋白在食管正常黏膜組、LGIN組、HGIN組、ESCC組的陽性率分別為6.3%、14.3%、23.5%、21.9%；統(tǒng)計分析顯示，PIK3CB在ESCC組中的表達高于食管正常黏膜組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而食管正常黏膜組與LGIN組、HGIN組，ESCC組與LGIN組、HGIN組，兩兩相比，蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 食管鱗狀細胞癌癌變過程中HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB的表達差異

圖1 A.HPV16/18 E6在正常黏膜中呈陰性；B.HPV16/18 E6在食管低級別異型增生部分細胞核中呈陽性；C.HPV16/18 E6在食管高級別異型增生細胞核中呈陽性；D.HPV16/18 E6在食管鱗狀細胞癌細胞核中呈陽性，EnVision法 圖2 A.p53在正常黏膜中呈陰性；B.p53在食管低級別異型增生部分細胞核中呈陽性；C.p53在食管高級別異型增生細胞核中呈陽性；D.p53在食管鱗狀細胞癌細胞核中呈陽性，EnVision法 圖3 A.PIK3CA在正常黏膜中呈陰性；B.PIK3CA在食管低級別異型增生細胞質(zhì)中呈弱陽性；C.PIK3CA在食管高級別異型增生細胞質(zhì)中呈陽性；D.PIK3CA在食管鱗狀細胞癌細胞質(zhì)中呈陽性，EnVision法 圖4 A.PIK3CB在正常黏膜中呈陰性；B.PIK3CB在食管低級別異型增生細胞質(zhì)中呈弱陽性；C.PIK3CB在食管高級別異型增生細胞質(zhì)中呈中等陽性；D.PIK3CB在食管鱗狀細胞癌細胞質(zhì)中呈強陽性，EnVision法

2.2 ESCC中HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB表達與臨床病理特征的關(guān)系HPV16/18 E6蛋白在ESCC中的表達與腫瘤發(fā)病部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，其中在頸段與上段、分化程度高、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中，HPV16/18 E6蛋白呈高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。p53與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，在浸潤深度深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌中，其呈高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PIK3CA、PIK3CB表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ESCC中，兩者呈高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 ESCC癌變過程中HPV16/18 E6與p53、PIK3CA、PIK3CB表達的相關(guān)性HPV16/18 E6與p53在ESCC組中的表達呈正相關(guān)(r=0.202，P=0.018)，在LGIN、HGIN組中無明顯相關(guān)性(P>0.05)。HPV 16/18 E6與PIK3CA在HGIN組、ESCC組中的表達均呈正相關(guān)(r=0.368，P=0.021；r=0.198，P=0.018)，在LGIN組中無明顯相關(guān)性(P>0.05)。HPV16/18 E6與PIK3CB在LGIN組、HGIN組、ESCC組中的表達均無明顯相關(guān)性(P>0.05，表3)。

表3 食管不同病變組織中HPV16/18 E6與p53、PIK3CA、PIK3CB表達的相關(guān)性

2.4 HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB表達與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系137例ESCC患者中位生存時間為44個月，5年生存率為28.5%。HPV16/18 E6蛋白陽性與陰性患者的5年生存率分別為46.3%、20.8%(圖5)；p53蛋白陽性與陰性患者的5年生存率分別為23.4%、39.5%；PIK3CA陽性與陰性患者的5年生存率分別為17.1%、32.4%。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，與ESCC預(yù)后相關(guān)的因素包括HPV16/18 E6、p53、PIK3CA和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05，圖5)。Cox多因素生存分析結(jié)果顯示，影響ESCC患者預(yù)后的獨立因素包括HPV16/18 E6、p53、PIK3CA和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而患者年齡、性別、腫瘤體積、腫瘤分化程度、PIK3CB均非ESCC患者預(yù)后的獨立因素(表4)。

圖5 食管鱗狀細胞癌患者Kaplan-Meier生存曲線：A.HPV16/18 E6蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系；B.p53蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系；C.PIK3CA蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系；D.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后的關(guān)系

表4 食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后多因素生存分析

3 討論

食管癌的發(fā)病率位居全球惡性腫瘤的第8位[12-13]。食管癌有多種組織病理學(xué)類型，其中90%為ESCC。ESCC的治療方案主要是手術(shù)切除后輔以放、化療，但晚期ESCC患者的預(yù)后仍然較差[14]。因此，迫切需要闡明食管癌的發(fā)病機制，尋找有效的靶向分子以預(yù)警食管癌的發(fā)生。

病毒感染與多數(shù)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如EB病毒與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤的發(fā)生有關(guān)。研究證實，HPV是多發(fā)性惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的危險因素[15-17]。1982年Syrjanen[18]最早提出食管癌的發(fā)生可能與HPV感染有關(guān)。研究顯示，HPV16、18感染是食管癌發(fā)生、發(fā)展的高危因素[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著食管癌的發(fā)生、發(fā)展，即由正常食管組織→LGIN→HGIN→ESCC的過程中，HPV16/18 E6蛋白陽性率逐漸增高，表明在ESCC的進展過程中HPV16、18感染可能通過某種途徑促進ESCC的發(fā)生。研究表明[6, 20]，HPV16/18 E6蛋白可與細胞內(nèi)E6相關(guān)蛋白(E6-AP)形成復(fù)合物，特異性結(jié)合p53，抑制p53的抑癌作用，p53基因會發(fā)生失活或突變，通過促進下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細胞停滯在G1期，使得癌細胞的增殖/凋亡比例失衡，致使ESCC進一步惡化。本實驗結(jié)果亦顯示，p53蛋白在ESCC組中的突變率高于食管正常黏膜組和LGIN組，在HGIN組中的表達高于食管正常黏膜組，且p53突變與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。同時，在ESCC組中，HPV16/18 E6蛋白與p53突變呈正相關(guān)，而在LGIN、HGIN組中無明顯相關(guān)性。作者認為，HPV16/18 E6蛋白在食管鱗狀上皮異型增生階段，可能并非通過激活p53通路，而是通過其他途徑完成。在ESCC中，HPV16/18的持續(xù)感染通過非特異性激活p53通路，導(dǎo)致p53失活或突變，進而促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。

HPV的持續(xù)感染可導(dǎo)致多種信號通路異常激活[21-22]。其中，HPV感染可引起PI3K/Akt信號通路中多種細胞因子的異常激活，進而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[23]。Marquard等[24]研究發(fā)現(xiàn)，頭頸部鱗狀細胞癌中PI3K/Akt信號通路的異常激活與HPV感染密切相關(guān)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)。Beaty等[25]研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA突變與HPV相關(guān)的口咽鱗狀細胞癌的化療后無瘤生存期有關(guān)。Madera等[26]認為抑制PIK3CA表達和HPV感染可抑制口腔鱗狀細胞癌的生長。本實驗結(jié)果顯示，PIK3CA、PIK3CB蛋白在ESCC組的表達高于食管正常黏膜組；并且PIK3CA、PIK3CB表達與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。作者認為，PIK3CA蛋白高表達可激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路，使細胞快速生長，并失去分化成熟能力，同時，該通路的異常激活可能在促進血管形成、腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。同時，在HGIN及ESCC組中，HPV16/18 E6蛋白表達均與PIK3CA呈正相關(guān)。作者推測，在食管HGIN向ESCC進展過程中，HPV的持續(xù)感染導(dǎo)致HPV16/18 E6蛋白表達上調(diào)，誘導(dǎo)腫瘤中PIK3CA突變，進而激活PI3K/Akt信號通路，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。因此，臨床內(nèi)鏡篩查食管疾病時，可通過檢測HPV感染并靶向治療HPV感染，可能會減緩或阻止ESCC的發(fā)生、發(fā)展。

影響ESCC預(yù)后的因素眾多。本組通過Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明，HPV16/18 E6、p53、PIK3CA及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均與ESCC患者預(yù)后密切相關(guān)。Cox多因素生存分析顯示，HPV16/18 E6是提示ESCC良好預(yù)后的獨立因素；p53、PIK3CA及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是ESCC預(yù)后的獨立危險因素。作者認為，發(fā)生于食管頸段及胸上段、分化程度較高及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ESCC患者中，HPV16/18 E6蛋白陽性率更高，其可能是由于HPV16/18 E6蛋白過表達誘導(dǎo)的ESCC發(fā)生部位較高，患者自發(fā)癥狀較早，可早期獲得治療有關(guān)；而其誘導(dǎo)的腫瘤分化程度較高，且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，也可能是HPV16/18 E6蛋白陽性患者預(yù)后較好的潛在原因。同時，HPV16/18 E6蛋白高表達可導(dǎo)致p53和pRB的失活或突變，促進基因組重排[27]，而DNA重排患者對放、化療更敏感，使得HPV16/18 E6陽性腫瘤患者的生存率更高。

綜上所述，在ESCC癌變過程中存在HPV16/18 E6蛋白、p53和PIK3CA、PIK3CB蛋白高表達，并且HPV感染與PIK3CA突變密切相關(guān)。因此，聯(lián)合檢測HPV16/18 E6蛋白和PIK3CA突變對ESCC的預(yù)后判斷和優(yōu)化治療具有重要意義。然而，本實驗僅對HPV16/18 E6蛋白和p53、PIK3CA、PIK3CB表達的相關(guān)性及其臨床意義進行初步探討，還需增加樣本量進一步分析，并深入開展細胞、分子機制的分析，為臨床靶向藥物的選擇提供可靠依據(jù)。