重離子輻照誘變增強枯草芽孢桿菌纖維素降解能力

張麗敏 李永麗 胡建華 崔金娜 劉占英 朱明達

1（內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院 呼和浩特 010051）

2（內(nèi)蒙古自治區(qū)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)節(jié)能減排工程技術(shù)研究中心 呼和浩特 010051）

3（生物發(fā)酵綠色制造內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心 呼和浩特 010051）

植物纖維素是自然界中最豐富的可再生資源。借助纖維素酶的水解作用，將纖維素轉(zhuǎn)化為可直接利用的資源與能源，可以緩解能源危機以及能源對環(huán)境污染的問題，同時也可以實現(xiàn)對農(nóng)業(yè)剩余資源的高效利用。纖維素酶是一類將纖維素水解成葡萄糖的酶的統(tǒng)稱，又可將纖維降解為可被畜禽機體消化吸收的還原糖，從而提高飼料利用率，纖維素酶的產(chǎn)生菌包括細菌、真菌和放線菌等。但細菌產(chǎn)纖維素酶的量較少，產(chǎn)酶活力也不高，導(dǎo)致應(yīng)用成本偏高，限制了細菌纖維素酶在飼料工業(yè)中產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用。因此，選育高纖維素酶活性的菌株具有重要的現(xiàn)實意義。重離子束作為一種高效的人工電離輻射，已經(jīng)越來越多地出現(xiàn)在研究者們的視線中，重離子輻照誘變可獲得更高的突變率和更廣的突變類型，目前已被廣泛用于微生物的誘變選育中［1-2］。姜伯玲［3］選育得到1 株經(jīng)重離子輻照誘變后的高產(chǎn)纖維素酶突變菌株，最終使纖維素酶的濾紙酶活最大提高了68.87%。韓鵬軍等［4］應(yīng)用不同劑量12C+6重離子束對金霉素鏈霉菌進行輻照誘變，金霉素鏈霉菌的誘變效果顯著，發(fā)酵效價較未誘變菌株提高14.4%。麻和平［5］采用重離子束12C6+對產(chǎn)細菌素植物乳桿菌進行輻照選育，正突變菌株Lp092、Lp085 抑菌圈直徑比出發(fā)菌株分別擴大了20.64%、19.36%，且均具有良好的產(chǎn)細菌素遺傳穩(wěn)定性。Yadav 等［6］采用低強度離子對枯草芽孢桿菌ABDR0 進行輻照，篩選到一株高活力纖維素酶生產(chǎn)菌株。

這些誘變育種取得了一定的研究成果，加速了重離子束輻照誘變育種的研究與應(yīng)用，也獲得了較大的經(jīng)濟效益與社會效益［7］。本研究以產(chǎn)纖維素酶的枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，通過對其進行80 MeV/u 的12C6+離子束輻照誘變，以期篩選出高纖維素降解突變株，并且獲得一種改良枯草芽孢桿菌的有效途徑，為生產(chǎn)飼料添加劑提供一種優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp.subtilis24799）、枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp.subtilis24739）、枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp.subtilis24603）：購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis1.7417）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis1.6757）：購買于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、瓊脂20.0。篩選培養(yǎng)基（g/L）：羧甲基纖維素鈉10.0、蛋白胨10.0、酵母提取粉5.0、NaCl 10.0、磷酸二氫鉀1.0、硫酸鎂0.5、瓊脂20.0。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米麩皮2.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、磷酸二氫鉀1.0、硫酸鎂0.5。上述培養(yǎng)基均用去離子水定容，并調(diào)節(jié)pH=7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 纖維素降解率與內(nèi)切葡聚糖苷酶活力測定

纖維素降解率測定參照文獻［8-9］。

繪制葡萄糖標準曲線后，采用二硝基水楊酸（DNS）法［10］測定內(nèi)切葡聚糖苷酶活力。

酶活力（U）定義：在50 ℃，pH=7.0 的條件下，每1 mL 粗酶液每分鐘分解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 μmol 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.2.2 重離子輻照誘變選育高纖維素降解率枯草芽孢桿菌

采用中國科學(xué)院近代物理研究所的蘭州重離子研究裝置（HIRFL）進行輻照誘變。12C6+離子束能量80 MeV/u，吸收劑量分別為0 Gy、40 Gy、80 Gy、120 Gy、160 Gy和200 Gy。

誘變后菌株致死率計算見式（1）。將未輻照與輻照后菌液進行梯度稀釋后，均勻涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。然后統(tǒng)計菌落數(shù)進行致死率的計算。

采用剛果紅染色法［11］篩選具有產(chǎn)纖維素酶能力的菌株。將上述活化好的菌株進行梯度稀釋，并取40 μL 于羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基上涂布，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌落長出后在培養(yǎng)皿上滴加0.5%剛果紅溶液染色15 min，5%NaCl 溶液脫色15 min，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍會出現(xiàn)透明圈。記錄透明圈（H）與菌落（C）直徑，并按公式（2）進行正突變率計算。

高纖維素降解率菌株的復(fù)篩。測定纖維素降解率及內(nèi)切葡聚糖苷酶活力。

降解率穩(wěn)定性測定。將復(fù)篩得到的突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 在相同條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)12次［12］，每隔兩代測定其纖維素降解率及纖維素酶活力，觀察其穩(wěn)定性。

1.2.3 高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

對發(fā)酵時間、溫度和pH 發(fā)酵條件進行優(yōu)化，提高菌株對纖維素降解的能力。設(shè)置3個發(fā)酵平行組，以5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)216 h，分別測定培養(yǎng)24 h、72 h、120 h、168 h 和216 h 時纖維素降解率及內(nèi)切葡聚糖苷酶活力。根據(jù)測定結(jié)果選擇最優(yōu)培養(yǎng)時間，并在此培養(yǎng)條件下探索不同溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃）對纖維素降解率及酶活力的影響。根據(jù)測定結(jié)果選擇最適發(fā)酵溫度，在最適溫度的基礎(chǔ)上，設(shè)置不同的初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5），測定初始pH對纖維素降解率及酶活力的影響。最終確定發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 高纖維素降解能力出發(fā)菌株的篩選

枯草芽孢桿菌的生長曲線測定結(jié)果見圖1。由圖1可知，5株枯草芽孢桿菌的生長趨勢基本一致。在5～15 h 內(nèi)，細胞數(shù)量以對數(shù)增長，而Bacillus subtilisCGMCC1.7417 的生長情況明顯優(yōu)于其他4株菌，后期可重點關(guān)注該菌株的纖維降解能力及纖維素酶活力。綜合考慮細胞生物量等因素，選擇培養(yǎng)12 h的菌體細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 菌株生長曲線Fig.1 Growth curves of strains

菌株的生長速度只是菌株篩選的一項指標，本研究的主要目的在于篩選高纖維素降解率的枯草芽孢桿菌進而應(yīng)用到后續(xù)研究中，所以在上步研究的基礎(chǔ)上分別測定了幾株菌的纖維素降解率及內(nèi)切葡聚糖苷酶活力、外切葡聚糖苷酶活力、β-葡萄糖苷酶活力。經(jīng)測定以上5株菌不具備外切葡聚糖苷酶及β-葡萄糖苷酶活力。枯草芽孢桿菌纖維素降解率及酶活力測定結(jié)果見圖2。由圖2可知，5 株枯草芽孢桿菌的纖維素降解率均在30%～50%，而Bacillus subtilisCGMCC1.7417 的纖維素降解率較其他菌株高，同時內(nèi)切葡聚糖苷酶活力也為最高值。Bacillus subtilisCGMCC1.7417 的纖維素降解率和內(nèi)切葡聚糖苷酶活力分別為（45.06±2.51）%和（1.77±0.03）U/mL。結(jié)合菌株細胞生物量及纖維素降解率、內(nèi)切葡聚糖苷酶活力的測定結(jié)果，選定Bacillus subtilisCGMCC1.7417 作為后續(xù)實驗菌株。

圖2 高纖維素降解率和酶活力菌株篩選結(jié)果；肩注小寫字母不同表示差異顯著（p＜0.05），大寫字母不同表示差異極顯著（p＜0.01）Fig.2 Screening results of strains with high cellulose degradation rate and enzyme activity；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

2.2 誘變后菌株致死率和正突變率計算結(jié)果

選取稀釋梯度為10-5時的數(shù)據(jù)計算致死率，由圖3可知，該致死率曲線隨著吸收劑量的增大出現(xiàn)先增后降再增的趨勢。在吸收劑量為120 Gy 時，菌株致死率最高，為68.37%。重離子束輻照誘變過程中，細胞存活率隨吸收劑量的增加先上升后下降再上升，細胞存活曲線近似呈現(xiàn)“馬鞍形”變化趨勢，即說明細胞在高吸收劑量下仍可保持較高的突變率及存活率，突變譜大大增加［13］，致死率呈現(xiàn)“馬鞍形”劑量-效應(yīng)曲線［14］。

根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑之比計算誘變的正突變率，結(jié)果見圖3。

圖3 致死率、正突變率曲線Fig.3 Curves of mortality and positive mutation rate

如圖3所示，隨著吸收劑量的增大，菌株的正突變率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。綜合分析，吸收劑量為120 Gy 時，正突變率最高，為84.23%，且此時H/C值最大。由此說明，隨著吸收劑量的增大，致死率也隨之增高，此時DNA 的損傷程度越嚴重，菌株的突變率越高，越易發(fā)生正突變［15］。

2.3 高纖維素降解能力菌株的初篩與復(fù)篩

2.3.1 初篩結(jié)果

Bacillus subtilisCGMCC1.7417 經(jīng)重離子輻照誘變后，觀察菌落透明圈，同時測量H與C，計算H/C值，枯草芽孢桿菌誘變前后透明圈變化如圖4所示，初篩結(jié)果見表1。

由圖4和表1可知，枯草芽孢桿菌經(jīng)重離子輻照誘變后，大多數(shù)菌落的透明圈變大，即H/C值增大，說明其纖維素酶活力提高，為正突變；反之則為負突變。本實驗從約1 620個單菌落中，通過比較H/C值，初篩得到9株菌株，并按菌株吸收劑量進行命名，分別命名為CG-40-1、CG-80-1、CG-120-1、CG-120-2、CG-120-3、CG-200-1、CG-200-2、CG-200-3 和CG-200-4，原始菌株命名為CG-0。

圖4 誘變前后菌落透明圈：（a）出發(fā)菌株；（b）誘變后正突變菌株Fig.4 Colony transparent circles before and after mutagenesis：(a)starting strain；(b)mutagenic strains

表1 初篩結(jié)果Table 1 The results of primary screening

2.3.2 復(fù)篩結(jié)果

Bacillus subtilisCGMCC1.7417 經(jīng)重離子輻照誘變后，初篩得到9株菌株，對初篩菌株進行纖維素降解率及酶活力的測定進行復(fù)篩，復(fù)篩結(jié)果見圖5。

由圖5 可知，與原始菌株相比，9 株菌纖維素降解率均有提高，其中誘變菌株CG-40-1的纖維素降解率最高，為(53.07±0.75)%，與Bacillus subtilisCG-0相比，纖維素降解率提高了22.06%，酶活力也相應(yīng)提高了23.07%，說明經(jīng)重離子輻照誘變后枯草芽孢桿菌的纖維素降解率顯著提高。分析原因可能是經(jīng)過重離子誘變后，與產(chǎn)纖維素酶相關(guān)的基因發(fā)生改變導(dǎo)致其產(chǎn)量增加。與初篩結(jié)果相比，H/C值與纖維素降解率有一定的正相關(guān)性，說明初篩結(jié)果可靠。

圖5 高纖維素降解率和酶活力菌株復(fù)篩結(jié)果；肩注小寫字母不同表示差異顯著（p＜0.05），大寫字母不同表示差異極顯著（p＜0.01）Fig.5 Strains with high cellulose degradation rate and enzyme activity Rescreening results；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

重離子輻照作為一種微生物誘變的有效手段，在工業(yè)微生物的誘變選育將具有廣闊的應(yīng)用空間。本課題組劉艷新等［16］利用不同劑量12C6+重離子束對枯草芽孢桿菌B.subtilis20076進行輻照誘變，誘變后通過透明圈初篩和酶活力驗證復(fù)篩方式選育出一株復(fù)合酶活力較高的菌株B.subtilisKC-1。與原始菌株相比，其發(fā)酵液濾紙酶活力、內(nèi)切葡聚糖酶活力、β-葡萄糖苷酶活力、外切葡聚糖酶活力、蛋白酶活力和α-淀粉酶活力分別提高了20.2%、79.6%、98.2%、7.4%、10.4% 和27.4%，且遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，該突變株具有良好的穩(wěn)定性。薛林貴等［17］對芽孢桿菌屬菌株G-41進行兩次重離子輻照誘變處理，一次誘變篩選得到堿性蛋白酶高產(chǎn)突變株G-41-68，二次誘變獲得突變株15 Gy-54。兩株突變菌株的酶活力與原始菌株相比分別提高了1.58 倍和2.65 倍。重離子束輻照作為一種高效的誘變手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于我國工業(yè)微生物育種實踐中［18］，通過重離子輻照技術(shù)，可以有效得到生產(chǎn)性能較高的目的工業(yè)菌株。本實驗利用重離子輻照誘變枯草芽孢桿菌，誘變后菌株纖維素降解能力明顯提高，由此可見，重離子輻照可作為一種微生物誘變的有效手段，在工業(yè)微生物的誘變選育具有廣闊的應(yīng)用空間。

2.4 高纖維素降解能力菌株穩(wěn)定性測定

對誘變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 降解纖維素能力的穩(wěn)定性進行分析，連續(xù)傳代培養(yǎng)12 代，每隔2 代測其纖維素降解率及內(nèi)切葡聚糖苷酶活力，測定結(jié)果見圖6。

圖6 CG-40-1纖維素降解率和酶活力穩(wěn)定性結(jié)果；肩注小寫字母不同表示差異顯著（p＜0.05），大寫字母不同表示差異極顯著（p＜0.01）Fig.6 The cellulose degradation rate and enzyme activity stability results of CG-40-1；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

由圖6 可知，Bacillus subtilisCG-40-1 的纖維素降解率約為52%，各代之間差異不顯著，說明CG-40-1的具有良好的遺傳穩(wěn)定性。綜上所述，本實驗通過重離子誘變得到高纖維降解率菌株Bacillus subtilisCG-40-1，其纖維降解率顯著提高，與Bacillus subtilisCG-0 相比提高了22.03%。經(jīng)比較分析可知，重離子誘變枯草芽孢桿菌效果明顯，且與γ 射線、中子等輻照誘變相比，遺傳穩(wěn)定性更好［19］。

2.5 高纖維素降解能力菌株發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果與分析

考察突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 在不同發(fā)酵時間、溫度、pH條件下對纖維素的降解能力。

2.5.1 發(fā)酵時間對CG-40-1纖維素降解率的影響

突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 在不同發(fā)酵時間對纖維素降解能力的影響見圖7。由圖7可知，在0～216 h 突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 隨著發(fā)酵時間的延長，纖維素降解率、內(nèi)切葡聚糖苷酶活力不斷增大，120 h 之后纖維素降解率、內(nèi)切葡聚糖苷酶活力逐漸降低。原因可能是發(fā)酵后期培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)不足，pH 發(fā)生變化及溶氧不足導(dǎo)致菌株性能下降，纖維素降解率、內(nèi)切葡聚糖苷酶活力降低。說明發(fā)酵120 h 時纖維素降解率、內(nèi)切葡聚糖苷酶活力達到最大，此時纖維素降解率和內(nèi)切葡聚糖苷酶活力為(57.91±1.96)%和(2.33±0.02)U/mL，且差異顯著。因此，確定最佳發(fā)酵時間為120 h。

圖7 發(fā)酵時間對纖維素降解能力的影響；肩注小寫字母不同表示差異顯著（p＜0.05），大寫字母不同表示差異極顯著（p＜0.01）Fig.7 Effects of fermentation time on fiber degradability；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

2.5.2 發(fā)酵溫度對CG-40-1纖維素降解率的影響

原始菌株Bacillus subtilisCG-0 在不同發(fā)酵溫度對纖維素降解能力的影響見圖8。原始菌株Bacillus subtilisCG-0 在發(fā)酵溫度為35 ℃時，纖維素降解率及內(nèi)切葡聚糖苷酶活力最大，分別為(48.24±1.09)% 和(1.82±0.02) U/mL， 突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 在不同發(fā)酵溫度對纖維素降解能力的影響如圖9 所示。當溫度逐漸升高時，突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 纖維素降解率、內(nèi)切葡聚糖苷酶活力先增大后減小。當溫度為45 ℃時，纖維素降解率和內(nèi)切葡聚糖苷酶活力均達到峰值， 分別為(65.13±0.48)% 和(2.41±0.03)U/mL。由此可以說明，溫度過高或過低都會影響菌株纖維素酶活力，可能原因是溫度影響了菌株的生長繁殖，進而影響了產(chǎn)纖維素酶能力?？莶菅挎邨U菌經(jīng)重離子輻照誘變后，最適發(fā)酵溫度由35 ℃提高為45 ℃。研究表明，發(fā)酵溫度不僅會影響發(fā)酵速度，還會影響發(fā)酵產(chǎn)物的積累及活性［20］。在工業(yè)生產(chǎn)中，較高的發(fā)酵溫度有利于加快發(fā)酵速度，提高發(fā)酵效率，減少冷卻水的使用量，降低能耗和生產(chǎn)成本［21］。因此，確定突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 的最佳發(fā)酵溫度為45 ℃。

圖8 發(fā)酵溫度對出發(fā)菌株纖維素降解能力的影響；肩注小寫字母不同表示差異顯著（p＜0.05），大寫字母不同表示差異極顯著（p＜0.01）Fig.8 Effects of fermentation temperature on fiber degradability；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

圖9 發(fā)酵溫度對CG-40-1纖維素降解能力的影響；肩注小寫字母不同表示差異顯著（p＜0.05），大寫字母不同表示差異極顯著（p＜0.01）Fig.9 Effects of fermentation temperature on fiber degradability；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

2.5.3 初始pH對CG-40-1纖維素降解率的影響

研究表明，pH對發(fā)酵過程的影響極大，pH會對發(fā)酵中代謝途徑產(chǎn)生影響，同時也會影響發(fā)酵產(chǎn)物的活性［22］。適當?shù)膒H會促進發(fā)酵，因此發(fā)酵過程中選擇合適的pH 極為重要。突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1在不同初始pH對纖維素降解能力的影響如圖10 所示。突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 在pH 為5.5～7.5 內(nèi)均有酶活力，隨著初始pH的增大，纖維素降解率及內(nèi)切葡聚糖苷酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當初始pH為6.5時，纖維素降解率及內(nèi)切葡聚糖苷酶活力達到最大，分別為(67.79±0.49)%和(2.56±0.02) U/mL，且差異極顯著。而在pH≥6.5 時，纖維素降解率及內(nèi)切葡聚糖苷酶活力均有所下降，說明CG-40-1適在中性偏酸環(huán)境下生長。據(jù)文獻報道，中性偏酸環(huán)境下產(chǎn)纖維素酶菌株的酶活力更高［23-24］。通過分析，確定Bacillus subtilisCG-40-1 的最佳初始pH為6.5。

圖10 初始pH對纖維素降解能力的影響；肩注小寫字母不同表示差異顯著（p＜0.05），大寫字母不同表示差異極顯著（p＜0.01）Fig.10 Effects of initial pH on fiber degradability；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

3 結(jié)論

本研究選擇一株具有較高纖維素酶活力的枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，進行重離子輻照誘變。通過80 MeV/u 的12C6+離子束輻照后，從羧甲基纖維素鈉篩選培養(yǎng)基平板上分離出9株H/C值高的正突變菌株，其中突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1的H/C值及纖維降解率提高的幅度最大，為17.75%，酶活力經(jīng)過誘變后提高了23.08%。經(jīng)過12代傳代培養(yǎng)，菌株具有良好的纖維降解穩(wěn)定性。對其進行單因素優(yōu)化試驗后，最終得到突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 的最適發(fā)酵時間、溫度、初始pH 分別為120 h、45 ℃、6.5，在此發(fā)酵條件下纖維素降解率為(67.79±0.49)%，較未優(yōu)化時提高27.74%。與同類產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌相比，突變菌株Bacillus subtilisCG-40-1 對纖維素有良好的降解能力，纖維素酶活力高，具有相當廣闊的應(yīng)用前景。

近年來，眾多研究學(xué)者通過重離子輻照后獲得一些優(yōu)良的微生物突變體，并在生物工業(yè)中發(fā)揮了重要作用。因此，對重離子輻照生物體的誘變機理進行解析，將進一步提高該項技術(shù)的應(yīng)用價值。但是目前對重離子誘變機制的研究相對較少。幸運的是，隨著新的生物學(xué)技術(shù)為重離子誘變微生物機理研究提供了新的途徑。通過未來結(jié)合不同的組學(xué)工具來闡明重離子誘變的作用機制，將在高效利用微生物資源、改善生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮巨大的作用。

作者貢獻說明劉占英和張麗敏提出了本文的研究思路和實驗方案；張麗敏完成本文所有涉及的實驗及分析；李永麗和胡建華幫助解決實驗中遇到的難點；崔金娜和朱明達指導(dǎo)本文的撰寫及修改。所有作者均已閱讀并認可該論文最終版的所有內(nèi)容。