基于SSR分子標(biāo)記的重瓣萱草品種遺傳多樣性分析

張賀蕾，陳 芬，馬 麗，劉 博

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223800；2.大連海洋大學(xué) 科技與環(huán)境學(xué)院，江蘇 大連 116023）

0 引言

萱草（Hemerocallis fulva）又名金針菜、鹿箭、忘憂草等，是阿福花科（Asphodelaceae）萱草屬（Hemerocallis L.）的多年生宿根草本花卉。其品種種類繁多，花色豐富多彩，花型千變?nèi)f化，適應(yīng)性強(qiáng)，喜陽(yáng)光又耐半蔭，喜干旱又耐濕潤(rùn)。萱草屬植物有15～18種，主要分布于亞洲溫?zé)釒е翢釒У貐^(qū)，原產(chǎn)于我國(guó)的約有11種［1］。重瓣萱草（Hemerocallis fulva var. kwanso Regel）多為雄蕊瓣化，花瓣數(shù)多于6，根肉質(zhì)，葉片較寬，早上開花晚上凋謝，花型獨(dú)特，可分為芍藥型重瓣和套疊型重瓣［2］；因其花瓣多重層次感強(qiáng)，近年來還出現(xiàn)了重瓣卷邊型、重瓣花心環(huán)型、重瓣鑲邊型等［3］。由于重瓣萱草的自然結(jié)實(shí)率偏低，其繁殖方式以分株繁殖為主［4］，多叢植、片植、行植于花帶和花境中，也可作樹林地被植物。此外，萱草是我國(guó)傳統(tǒng)的母親花，寓意著偉大的母愛，近年來，越來越多的優(yōu)新品種流行于家庭園藝。同時(shí)，萱草作為金針菜的近親，依托黃花菜產(chǎn)業(yè)不僅促進(jìn)了休閑農(nóng)業(yè)的打造，促進(jìn)了金針菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的提檔升級(jí)，而且是“美麗鄉(xiāng)村”建設(shè)中不可多得的鄉(xiāng)土植物［5］。

遺傳多樣性是一個(gè)群體或者種內(nèi)個(gè)體之間的遺傳變異總和。不同物種的遺傳多樣性都是獨(dú)一無二的，都儲(chǔ)存在其基因中，是長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物。目前，與國(guó)外相比，我國(guó)重瓣萱草育種工作進(jìn)展較為緩慢，應(yīng)用于我國(guó)的重瓣萱草大部分都是國(guó)外培育的品種。主要是由于不斷的反復(fù)雜交，沒有新的基因加入，從而使其種間差別不顯著。因此，利用分子生物學(xué)手段，從分子水平研究重瓣萱草品種的親緣關(guān)系和遺傳背景是十分重要的［6］。

SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)電泳法是近年來發(fā)展起來的一種以DNA測(cè)序儀為平臺(tái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的一種方法［7］；與銀染法相比，熒光測(cè)序技術(shù)每個(gè)位點(diǎn)多檢測(cè)3個(gè)等位變異，檢測(cè)效果更加準(zhǔn)確、高效［8］。它不僅實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增產(chǎn)物電泳的自動(dòng)化，而且實(shí)現(xiàn)了電泳數(shù)據(jù)記錄的自動(dòng)化［9］，該方法已在研究樣本遺傳多樣性、基因鑒定中得到應(yīng)用。本研究選用34個(gè)重瓣萱草品種作為實(shí)驗(yàn)材料，利用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，從DNA水平上探討了重瓣萱草的遺傳多樣性和多態(tài)性水平，并根據(jù)其遺傳相似系數(shù)進(jìn)行了聚類分析，以期加快發(fā)掘優(yōu)異的基因資源，推進(jìn)重瓣萱草種質(zhì)資源的分子育種研究，為今后培育更多的重瓣萱草新品種提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為從國(guó)內(nèi)外收集的32種重瓣萱草品種：殘酷的命運(yùn)、粉娃娃、摩西火、雙子座侍者、四十二街、紫色糖、粉紅、鋼琴男子、午后、謊言和口紅、太空海岸雪天使、強(qiáng)盜、邊境松露、國(guó)家的驕傲、荷葉雙摺邊、天馬行空富麗、夏娃、摩洛哥夏季、獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷、快樂的流氓、黃鶴樓、中國(guó)山、事理情歌、萊邦、命定、蕾絲方巾、驚艷、黃色公主、冰淇淋、粉紅女孩、雙面嬌娃、雙重美味。還有2種重瓣萱草品種是以‘酒紅341’（單瓣型）作為母本，‘蕾絲方巾’作為父本，雜交后獲得的F1代品種：15087-3、15087-5。供試材料（表1）均栽植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所萱草種質(zhì)資源圃內(nèi)，采用分株繁殖栽培方式，每個(gè)材料分割成3株，株距為20 cm左右，行距25 cm左右，并將其標(biāo)號(hào)。采用正常的水肥管理方法，定期除草，使其始終保持干凈的生長(zhǎng)環(huán)境。

表1 34個(gè)重瓣萱草品種信息表

1.2 用CTAB法提取植物基因組DNA

DNA的提取采用優(yōu)化后的CTAB法：取34個(gè)重瓣萱草品種3～5 g新鮮材料的葉子或幼芽，剪碎，放到已加有鋼珠的2 mL的離心管中，再將離心管放入盛有液氮的保溫桶中，震蕩，磨碎；在其解凍之前迅速加入65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液600～700 μL，迅速搖勻；將粗提取液裝入1.5 mL的離心管中，在65 ℃水浴20 min，期間不時(shí)搖動(dòng)；隨后將離心管放進(jìn)離心機(jī)，以8000 r/min離心10 min，離心后輕拿輕放，為避免吸入雜質(zhì)，將上清轉(zhuǎn)到新的1.5 mL的離心管中；加入Glass Milk 3～5 μL和600 μL DNA Binding Buffer（或6 mol/L NaCl），充分混勻，在65 ℃水浴15 min，中間需翻轉(zhuǎn)；室溫放置5 min，放入離心機(jī)，4000 r/min離心1 min，棄上清，留管底，加入500 μL無水乙醇，吹打懸浮，洗滌，8000 r/min離心1 min；棄上清，重復(fù)上一步，再次加入500 μL無水乙醇，吹打懸浮，洗滌，8000 r/min離心1 min，棄上清，室溫干燥；最后加100 μL TE（pH 7.0），70 ℃水浴5 min，離心，吸取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，放冰箱-20 ℃保存。

1.3 熒光毛細(xì)管電泳SSR-PCR擴(kuò)增體系

反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中包含模板DNA（20 ng/μL）2 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTP（25 mmol/L）2 μL、熒光標(biāo)記（FAM）正向SSR引物（5 μmol/L）1 μL、方 向 引 物（5 μmol/L）1 μL、rTap酶（5 U/μL）0.2 μL、ddH2O 16.3 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min；55～59 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后60 ℃延伸30 min，4 ℃保存。

1.4 熒光毛細(xì)管電泳位點(diǎn)信息監(jiān)測(cè)

將PCR產(chǎn)物移入分析區(qū)無菌通風(fēng)櫥上進(jìn)行后續(xù)操作。取96孔板，在板的側(cè)壁上寫上上機(jī)板號(hào)，如SSR_20210501-YuMI-1E。取20 μL Rox500內(nèi)標(biāo),加入980 μL去離子甲酰胺內(nèi)，渦漩混勻，離心，以每孔8 μL分裝到新的96孔板內(nèi)，再取2 μL PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)地加入各孔中（加PCR產(chǎn)物時(shí)檢查2個(gè)板是否對(duì)應(yīng)一致，是否將96孔板放倒，確保每孔對(duì)應(yīng)正確）。最后將PCR產(chǎn)物板蓋上密封膜，存留；將測(cè)序跑樣板蓋上封口膜，短暫離心后，于95 ℃變性5 min，結(jié)束后立刻放到冰盒內(nèi)保存5～10 min；然后將封口膜慢慢揭掉，更換96孔膠皮墊，離心。打開ABI3730xl儀器及電腦，待穩(wěn)定后打開信號(hào)收集軟件。

1.5 數(shù)據(jù)分析

待34個(gè)重瓣萱草電泳結(jié)束后，用GeneMapper 4.0軟件對(duì)樣品的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，直接讀取樣品SSR片段長(zhǎng)度，再利用Popgene和Power Marker V 3.25進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換并分析，計(jì)算出主等位基因頻率、基因型數(shù)、等位基因數(shù)、基因多樣性、雜合度、多態(tài)性信息含量等遺傳多樣性相關(guān)指標(biāo)。利用NTSYS-pc 2.10 e算出遺傳相似系數(shù)，繪制聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選及優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)引物均由青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測(cè)有限公司合成。共合成302對(duì)引物，并根據(jù)SSR Hunte檢測(cè)到的SSR位點(diǎn)進(jìn)行篩選，初步篩選出PCR相對(duì)穩(wěn)定、具有多態(tài)性、重復(fù)性好的12對(duì)高多態(tài)性引物（表2），并將其優(yōu)化后，對(duì)34個(gè)重瓣萱草品種進(jìn)一步進(jìn)行位點(diǎn)檢測(cè)。

表2 12對(duì)SSR引物信息表

2.2 多態(tài)性分析

34個(gè)重瓣萱草品種在12對(duì)高多態(tài)性SSR引物上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見表3。12對(duì)高多態(tài)性SSR引物共獲得111個(gè)等位基因，平均9.2500個(gè)，34個(gè)重瓣萱草品種的遺傳多樣性變化（基因多樣性）范圍為0.5826～0.9277，多態(tài)性信息含量（PIC）變 化 范 圍 為0.5684～0.9236，最 高 的 均 為P5，最低的均為P7。遺傳多樣性平均值為0.8043，多態(tài)性信息含量（PIC）平均值為0.7875，Shannon信息指數(shù)（I）平均值為1.8753，觀測(cè)雜合度變化范圍為0.1333～0.7333，期望雜合度變化范圍為0.5057～0.9385（表4），說明34個(gè)重瓣萱草品種之間遺傳基礎(chǔ)廣，遺傳多樣性處于較高水平。在位點(diǎn)P5的遺傳多樣性水平偏離平衡程度最低，在位點(diǎn)P7的遺傳多樣性水平偏離平衡程度最高。

表3 12對(duì)SSR引物對(duì)34個(gè)重瓣萱草品種的擴(kuò)增結(jié)果

表4 12對(duì)引物對(duì)34個(gè)重瓣萱草品種的SSR遺傳多樣性

2.3 UPGMA聚類分析

34個(gè)重瓣萱草品種基于遺傳相似系數(shù)矩陣，采用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，根據(jù)聚類樹狀圖（圖1），在距離系數(shù)L=0.4128處，可將這34個(gè)種質(zhì)劃分為兩大類群?！袊?guó)山’‘雙面嬌娃’‘粉紅女孩’‘雙重美味’4個(gè)重瓣萱草品種聚成類群Ⅰ，‘殘酷的命運(yùn)’‘粉娃娃’‘摩西火’‘雙子座侍者’‘四十二街’等30個(gè)重瓣萱草品種聚成類群Ⅱ，其中重瓣萱草‘摩洛哥夏季’在L=0.4108時(shí)與類群Ⅱ聚在一起，說明重瓣萱草‘摩洛哥夏季’與類群Ⅱ的相似性大于與類群Ⅰ的相似性，在L=0.4128時(shí)聚到一起。這表明兩大類群之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，存在較大的遺傳差異。

圖1 UPGMA法構(gòu)建的34種重瓣萱草品種的樹狀聚類圖

類群I可劃分為2個(gè)亞類：（I）亞類和（Ⅱ）亞類，其中（I）亞類為24號(hào)‘萊邦’，（Ⅱ）亞類又分A、B 2個(gè)小亞類。在B小亞類中，32號(hào)‘雙面嬌娃’、34號(hào)‘雙重美味’聚類在一起，與A小亞類中的33號(hào)‘粉紅女孩’聚成（Ⅱ）亞類。這一類群中4個(gè)重瓣萱草品種內(nèi)外花被片顏色相同，且紅色系為主要色系，花瓣寬度較大，葉片寬度均較寬，著花密度較大。

類群Ⅱ包括重瓣萱草‘殘酷的命運(yùn)’‘粉娃娃’‘摩西火’‘雙子座侍者’等共計(jì)30個(gè)重瓣萱草品種，其中7號(hào)‘粉紅’、30號(hào)‘黃色公主’組成小類，與31號(hào)‘冰淇淋’聚在一起，再與（Ⅲ）亞類聚成Ⅱ大類。在所有供試的重瓣萱草品種中，28號(hào)‘15087-3’、29號(hào)‘15087-5’最早聚在一起，說明這2種重瓣萱草親緣關(guān)系極其接近，它們的相似性最高，遺傳差異最小，聚類后又與26號(hào)‘蕾絲方巾’在0.2500時(shí)聚在一起，這與28號(hào)‘15087-3’和29號(hào)‘15087-5’是以‘酒紅341’作為母本，‘蕾絲方巾’作為父本雜交后所得F1代品種相一致。這一類群中的30個(gè)重瓣萱草品種顏色多樣，有紅色、紫紅、橙紅、橙黃、黃色、橙色六大色系，且花序形態(tài)多樣，葉叢姿態(tài)均為半直立，葉叢高度均為中等，直徑較小，內(nèi)外花被片邊緣波皺程度較強(qiáng)。

3 討論

隨著我國(guó)大力推廣生態(tài)型、節(jié)約型的園林綠化理念，宿根花卉在園林中發(fā)揮著越來越重要的作用［10］，萱草以行植、叢植、群植的配置方式大量栽植于花境、花壇中。重瓣萱草因其獨(dú)特花型具有較高的觀賞性，深受人們的喜愛，但我國(guó)對(duì)萱草的

研究仍處于初級(jí)階段，對(duì)重瓣萱草的研究更少，對(duì)其進(jìn)行分類始終存在困難，進(jìn)而無法充分掌握萱草的遺傳信息，影響了育種工作的進(jìn)一步開展［11］。同時(shí)，我國(guó)重瓣萱草雜交所依賴的種質(zhì)基礎(chǔ)薄弱，萱草種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，并且常出現(xiàn)雜交不親和現(xiàn)象，使得難以選育出有突破性的新品種。我國(guó)學(xué)者通過分子標(biāo)記的方法對(duì)萱草遺傳多樣性研究較少，對(duì)重瓣萱草的研究更是寥寥無幾，并且前人對(duì)萱草的分子標(biāo)記研究主要是利用EST-SSR［12］、ISSR［13］等標(biāo)記。本研究利用SSR分子標(biāo)記對(duì)34個(gè)重瓣萱草品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，共篩選出PCR相對(duì)穩(wěn)定、重復(fù)性好、可擴(kuò)增出預(yù)期大小片段的12對(duì)引物，且它們都具有較高的多態(tài)性（PIC＞0.5），這12對(duì)引物中共擴(kuò)增出604條條帶，多態(tài)性百分率達(dá)100%。對(duì)比任陽(yáng)［14］使用ISSR分子標(biāo)記對(duì)50個(gè)萱草屬植物的研究中共擴(kuò)增出196條條帶，多態(tài)性百分率為96.43%；彭澤宇［15］使用SRAP分子標(biāo)記對(duì)13個(gè)萱草品種的研究表明，多態(tài)性百分率為90.1%，本研究的多態(tài)性百分率均比其高。本實(shí)驗(yàn)采用熒光毛細(xì)管電泳法可以準(zhǔn)確區(qū)分出34個(gè)重瓣萱草品種，克服了聚苯烯酰胺凝膠電泳法中人工對(duì)SSR片段辨別產(chǎn)生的誤差［16］，說明熒光毛細(xì)管電泳法的多態(tài)性和開發(fā)效率均較高，可有效地解釋材料間的遺傳差異，同時(shí)，也印證了該方法可以對(duì)不同重瓣萱草的遺傳多樣性水平進(jìn)行鑒定和研究。

隨著科技水平的不斷提高，SSR分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性的研究中，研究的成功與否取決于選用的分子標(biāo)記的基因型數(shù)和質(zhì)量的準(zhǔn)確性［17］。朱華芳等［18］利用5對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)6個(gè)萱草原種或變種和14個(gè)萱草園藝品種進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出23條條帶，擴(kuò)增片段大小在600～100 bp之間。本研究利用12個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)34個(gè)重瓣萱草品種進(jìn)行檢測(cè)，共獲得了111個(gè)等位基因，平均9.2500個(gè)，遺傳多樣性平均值為0.8043，多態(tài)性信息含量（PIC）平均值為0.7875，Shannon信息指數(shù)（I）平均值為1.8753，表明各供試材料間遺傳多樣性水平較高；與此同時(shí)，平均觀測(cè)雜合度明顯低于期望雜合度（表3），說明這34個(gè)重瓣萱草品種純合子合體較多。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為重瓣萱草品種的功能基因定位奠定了一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為之后的研究提供了純度鑒定依據(jù)。

羅軍武等［19］研究認(rèn)為，彼此間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近可以通過遺傳距離的大小反映出來。戴李川［20］研究表明，遺傳距離越大，遺傳多樣性越高，遺傳基礎(chǔ)越廣泛。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，34個(gè)重瓣萱草品種的遺傳相似系數(shù)范圍為0.225～0.413，在聚類分析圖中，類群I中的4個(gè)重瓣萱草品種與類群Ⅱ中的30個(gè)重瓣萱草品種親緣關(guān)系相對(duì)較近；28號(hào)‘15087-3’、29號(hào)‘15087-5’最早聚在一起，說明這2種重瓣萱草的親緣關(guān)系極其接近。重瓣萱草在遺傳進(jìn)化與育種中基因庫(kù)較為局限，遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，有可能是因?yàn)樵谟N時(shí)選擇的親本較為接近。因此，在遺傳相似系數(shù)較低的重瓣萱草品種中應(yīng)加快發(fā)掘優(yōu)異的基因資源，從而推進(jìn)重瓣萱草品種的分子育種研究，以期為今后培育更多的重瓣萱草新品種提供參考和依據(jù)。