深黃傘形霉與黑曲霉混合固態(tài)發(fā)酵麩皮積累油脂

鄭 瀟， 馮 豪， 于 潔， 王子碩， 周化嵐，Sarman Oktovianus Gultom， 張建國(guó)*

1.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，食品科學(xué)與工程研究所，上海200093；

2.Department of Agricultural and Biosystems Engineering，Papua University Manokwari，Papua Barat，Indonesia

油脂作為人類生活和生產(chǎn)活動(dòng)中不可缺少的物質(zhì)［1］，不僅是構(gòu)成和維持細(xì)胞生命的重要大分子物質(zhì)，還是人類重要的能量物質(zhì)來源。我國(guó)是一個(gè)人口大國(guó)，油脂供應(yīng)短缺，根據(jù)現(xiàn)有資源無法滿足社會(huì)需要。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年我國(guó)食用油消費(fèi)量達(dá)3 167.4萬噸，約60%油脂的缺口需要通過進(jìn)口［2］。因此，人們正在積極開發(fā)新的油源途徑。而深黃傘形霉（Umbelopsis isabellina，U．isabellina．曾用名深黃被孢霉和Mortierella isabellina，M．isabellina）可以利用多種糖生長(zhǎng)，有廣泛的底物適應(yīng)性和油脂積累潛力［3-5］。在日本，深黃傘形霉被用于生產(chǎn)單細(xì)胞油脂，這種單細(xì)胞油脂被用作飲料和糖果中的食品添加劑，并且以片劑的形式作為一種功能性食品［6，7］。這就消除了大規(guī)模使用深黃傘形霉的顧慮。并且，深黃傘形霉所需的營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，能利用碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵合成自身胞內(nèi)油脂，油脂含量可達(dá)86%，尤其富含油酸，亞油酸和γ-亞麻油酸［8］。

黑曲霉不僅是一種廣泛用于固體發(fā)酵的絲狀真菌，而且是FDA批準(zhǔn)的食品安全性好的工業(yè)微生物菌株。目前已廣泛用于檸檬酸、葡萄糖酸等［9］食品組分的工業(yè)生產(chǎn)。此外，黑曲霉可產(chǎn)出纖維素酶、纖維二糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果膠酶、檸檬酸合成酶［10-15］等多種酶，并可用來水解多種木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的廢棄物，例如土豆、菠蘿、豆渣、豆角梗、玉米芯、木薯、甘蔗渣、咖啡殼［16-18］，甚至可以水解人工的食品聚合物（聚氨酯）［19］。

固態(tài)發(fā)酵是微生物將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為油脂的一種簡(jiǎn)單方法，固態(tài)發(fā)酵是指沒有或有少量自由水存在下一種或多種微生物在固態(tài)基質(zhì)上生長(zhǎng)的生物反應(yīng)過程。固態(tài)發(fā)酵已經(jīng)廣泛用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)：例如微生物代謝物、工業(yè)用酶、中國(guó)傳統(tǒng)食品、以及油脂。固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)為操作方式簡(jiǎn)單、成本低，是一種容易推廣的處理方式。固態(tài)發(fā)酵條件下，絲狀真菌發(fā)酵示意圖如下（見圖1）：

圖1 絲狀真菌在固態(tài)發(fā)酵時(shí)生長(zhǎng)示意圖

研究也發(fā)現(xiàn)，制約固態(tài)發(fā)酵深黃傘形霉進(jìn)一步積累油脂的因素是產(chǎn)酶能力不足。添加外源纖維素酶后油脂產(chǎn)量明顯提高。ZHANG［20］將玉米芯經(jīng)過液氨預(yù)處理后利用酶水解釋放單糖時(shí)發(fā)現(xiàn)酶的需要量是50 FPU／g葡聚糖的纖維素酶，30 CBU／g葡聚糖的纖維二糖酶。所以，纖維素酶是富油微生物轉(zhuǎn)化食品廢棄物為油脂的必要條件。依據(jù)以上的分析，提出利用深黃傘形霉和黑曲霉在麩皮［21］上進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵積累油脂的思路，因?yàn)榛旌吓囵B(yǎng)固態(tài)發(fā)酵不僅有利于絲狀真菌的生長(zhǎng)和酶的分泌，也有利于絲狀真菌在基質(zhì)上的附著和對(duì)基質(zhì)的滲透。結(jié)合黑曲霉高效產(chǎn)多種酶和深黃傘形霉易積累油脂的優(yōu)點(diǎn)將食品廢棄物轉(zhuǎn)化為油脂，并且黑曲霉和深黃傘形霉兩株菌混合培養(yǎng)有利于食品廢棄物中糖的釋放、轉(zhuǎn)化過程中抑制物的去除以及油脂產(chǎn)量的提高。可以為食品中廢棄物資源的轉(zhuǎn)化以及可再生能源的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

深黃傘形霉（Umbelopsis isabellina，Mortierella isabellina NBRC 7884）購(gòu)自日本技術(shù)與評(píng)價(jià)研究所的生物資源中心（NBRC）、黑曲霉（Aspergillus niger ATCC 1015）購(gòu)自美國(guó)典型生物資源保藏中心（ATCC）、小麥麩皮（39.28%C、2.47%N）來自山東菏澤牡丹區(qū)，化學(xué)試劑購(gòu)買自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

光學(xué)顯微鏡CX40（奧林巴斯公司）；氣質(zhì)聯(lián)用儀7890A（Agilent Technologies公司）；分析天平ML104／02（梅特勒公司）；高壓滅菌鍋HVE-50（Hirayama）；全溫振蕩器TQZ-312（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（g／L）：稱取3.7 g PDA固體溶于100.0 mL去離子水，121℃、15 min滅菌后備用。

察氏培養(yǎng)基（g／L）：25.0無水葡萄糖，30.0 NaNO3，10.0 K2HPO4·3H2O，5.0 KCl，5.0 MgSO4·H2O，0.1 FeSO4，調(diào)節(jié)至pH 5.6，121℃、15 min滅菌后備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 深黃傘形霉孢子液的制備

將-20℃下貯藏的深黃傘形霉孢子液接種到PDA培養(yǎng)基上，在28℃下倒置培養(yǎng)，分別在7 d、9 d和11 d不同成熟度時(shí)收集孢子，用去離子水洗下，再以20%的甘油保藏，用血球板計(jì)數(shù)后備用。

1.3.2 黑曲霉孢子液的制備

將-20℃下貯藏的黑曲霉孢子液接種到察氏培養(yǎng)基平板上，在28℃下倒置培養(yǎng)，分別在7 d、9 d和11 d不同成熟度時(shí)收集孢子，用去離子水洗下，再以20%的甘油保藏，血球板計(jì)數(shù)備用。

1.3.3 初始含水量對(duì)雙菌培養(yǎng)積累油脂的影響

小麥麩皮為發(fā)酵原料，稱取30 g于250 mL三角瓶中，麩皮含水量分別50%、67%、75%和80%，121℃高壓滅菌20 min，然后按照深黃傘形霉∶黑曲霉（1∶1）將兩種菌混勻，孢子數(shù)為106CFU／g麩皮，28℃培養(yǎng)6周，每周定時(shí)取樣，取樣烘干保留，測(cè)定油脂含量。

1.3.4 孢子數(shù)對(duì)雙菌積培養(yǎng)累油脂的影響

小麥麩皮為發(fā)酵原料，稱取30 g于250 mL三角瓶中，麩皮含水量65%，121℃高壓滅菌20 min，然后按照深黃傘形霉∶黑曲霉（1∶1）將兩種孢子混勻，孢子濃度分別按104CFU／g、105CFU／g、106CFU／g和107CFU／g接入，28℃培養(yǎng)6周，每周定時(shí)取樣，取樣烘干保留，測(cè)定油脂含量。

1.3.5 孢子比例對(duì)雙菌培養(yǎng)油脂積累的影響

小麥麩皮為發(fā)酵原料，稱取30 g于250 mL三角瓶中，麩皮含水量分65%，121℃高壓滅菌20 min，然后按照深黃傘形霉：黑曲霉孢子比例2∶1、1∶1、1∶2將兩種孢子液混合，接入孢子濃度為106CFU／g麩皮，28℃培養(yǎng)6周，每周定時(shí)取樣，取樣烘干保留，測(cè)定油脂含量。

1.3.6 不同孢齡對(duì)雙菌積累油脂的影響

小麥麩皮為發(fā)酵原料，稱取30 g于250 mL三角瓶中，麩皮含水量65%，121℃高壓滅菌20 min，然后分別將孢齡為7 d、9 d和11 d孢子，按照深黃傘形霉：黑曲霉接菌1∶1比例將兩種菌液混合，接入孢子濃度為106CFU／g麩皮，28℃培養(yǎng)6周，每周定時(shí)取樣，取樣烘干保留，測(cè)定油脂含量。

1.3.7 油脂含量的測(cè)定

取烘干的深黃傘形霉0.1 g，加入10 mL配制好的氯仿∶甲醇＝2∶1，放入搖床180 r／min震蕩16 h。加入2.5 mL去離子水并搖勻1 min，再4 500 r／min離心10 min，取下層溶液經(jīng)過0.45μm濾膜過濾，70℃加熱去除氯仿，得到油脂。油脂稱重后計(jì)算菌體中油脂的含量。

1.3.8 脂肪酸組分的測(cè)定

取油脂0.10 g與10 mL氯仿∶甲醇∶濃硫酸（5∶4.25∶0.75）混合、搖勻，在90℃水浴90 min，加入2.5 mL去離子水，振蕩1 min，4 500 r／m離心15 min。然后將上層與3 mL氯仿混合，振蕩1 min，4 500 r／min離心15 min。將兩次所得氯仿層混勻過濾用于GC-MS分析。色譜柱為Agilent 19091S-433HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×250μm×0.25 μm）。升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，以15℃／min的速度升溫到180℃，保持1 min，再以10℃／min升溫到270℃，保持5 min。載氣為氦氣；流速為1 mL／min；壓力56.75 kPa；進(jìn)樣量為1μL，分流比10∶1。質(zhì)譜部分電子轟擊離子源的電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四級(jí)桿溫度150℃。圖譜采集方式為全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍m／z為20～550。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本研究所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，利用Microsoft Office 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 9.1軟件繪制所有數(shù)據(jù)圖，利用IBM SPSS Statistics 25軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 初始含水量對(duì)油脂產(chǎn)量的影響

在不同的初始水分含量培養(yǎng)條件下，不同初始水分含量的培養(yǎng)基油脂產(chǎn)量有著相對(duì)一致的趨勢(shì)。如圖2所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，油脂產(chǎn)量均呈現(xiàn)前4周下降，第4周到第6周略微上升的趨勢(shì)。而在培養(yǎng)初期，不同的初始水分含量對(duì)固態(tài)發(fā)酵初期的影響較大，如初始水分含量67%和75%的油脂產(chǎn)量明顯優(yōu)于50%和80%，這是因?yàn)楣虘B(tài)發(fā)酵初期，含水量過低、過高均不利于菌體的培養(yǎng)。當(dāng)水分含量過高時(shí)，培養(yǎng)基基質(zhì)顆粒之間結(jié)合較為緊密，通氣量不足，黑曲霉無法獲得足夠的氧氣進(jìn)行生長(zhǎng)。而當(dāng)水分含量過低時(shí)，培養(yǎng)基基質(zhì)過于干燥，并不利于菌絲的附著，因此不利于菌體生長(zhǎng)。且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水分含量不斷降低，黑曲霉與深黃傘形霉的生長(zhǎng)受到抑制，因此油脂產(chǎn)量逐漸下降。而在固態(tài)發(fā)酵末期此時(shí)黑曲霉利用自身的復(fù)合酶體系，將麩皮轉(zhuǎn)化為深黃傘形霉可利用的碳水化合物，油脂含量逐漸上升，因此最適初始水分含量為75%。

圖2 不同初始含水量對(duì)油脂產(chǎn)率影響

2.2 孢子數(shù)對(duì)油脂產(chǎn)量的影響

當(dāng)黑曲霉與深黃傘形霉混合發(fā)酵時(shí)，雖然不同的孢子數(shù)對(duì)油脂產(chǎn)量具有不同的影響，但不同接種孢子量的培養(yǎng)基油脂產(chǎn)率有著相對(duì)一致的趨勢(shì)，如圖3所示，油脂產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)前4周整體下降，4～6周，油脂產(chǎn)量上升趨勢(shì)。在混合固態(tài)發(fā)酵初期，第一周，此時(shí)接種的黑曲霉的孢子萌發(fā)，代謝旺盛，產(chǎn)出的酶較多，因此接菌量為106CFU／g和107CFU／g麩皮時(shí)，油脂產(chǎn)率較高，而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，低接菌量在固態(tài)發(fā)酵后期優(yōu)勢(shì)明顯，發(fā)酵末期接菌量為104CFU／g麩皮時(shí)，油脂產(chǎn)率較其他接菌量第二、四、六周都要高，這是因?yàn)檫^多的接種量會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)后期所需的營(yíng)養(yǎng)不足以支持其生長(zhǎng)，因此最適的孢子接種量為107CFU／g麩皮。

圖3 不同孢子數(shù)對(duì)油脂產(chǎn)率的影響

2.3 孢子比例對(duì)油脂產(chǎn)量的影響

不同的孢子比例對(duì)油脂產(chǎn)量具有不同的影響，當(dāng)黑曲霉占比較高，深黃傘形霉占比較低時(shí)，此時(shí)黑曲霉水解生成的碳水化合物較多，但缺乏足夠的深黃傘形霉將其轉(zhuǎn)化為油脂，因此油脂產(chǎn)量較低；而當(dāng)深黃傘形霉占比較高，黑曲霉占比較低時(shí)，此時(shí)水解生成的碳水化合物較少，深黃傘形霉可利用的碳水化合物較少，轉(zhuǎn)化生成的油脂較少，因此油脂產(chǎn)量較低。如圖4所示，黑曲霉和深黃傘形霉接入不同孢子比例時(shí)，油脂產(chǎn)量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)基本一致。當(dāng)黑曲霉和深黃傘形霉接菌比例為1∶1或者1∶2時(shí)，油脂產(chǎn)量隨時(shí)間變化趨勢(shì)更為相近，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)油脂產(chǎn)量逐漸下降，這是因?yàn)殡S著營(yíng)養(yǎng)的消耗菌種競(jìng)爭(zhēng)剩余營(yíng)養(yǎng)，因此油脂產(chǎn)量逐漸下降。而當(dāng)黑曲霉和深黃傘形霉接菌比例為2∶1時(shí)，0～2周油脂含量逐漸上升，在第二周達(dá)到峰值，隨后2～6周油脂含量逐漸下降，且當(dāng)黑曲霉和深黃傘形霉接菌比例為1∶2時(shí)，自第一周到第六周其油脂產(chǎn)量均優(yōu)于其他兩種接菌比例。因此，可知深黃傘形霉過量時(shí)的油脂產(chǎn)量比黑曲霉過量時(shí)更高，混合發(fā)酵過程中深黃傘形霉的比例對(duì)油脂產(chǎn)量的影響更為顯著，因此最適的孢子比例為黑曲霉∶深黃傘形霉＝1∶1。

圖4 不同孢子比例對(duì)油脂產(chǎn)率的影響

2.4 孢齡對(duì)油脂產(chǎn)量的影響

不同階段的孢子對(duì)深黃傘形霉積累油脂具有不同的影響，不同孢齡的孢子由于其生長(zhǎng)情況與自身的代謝程度不同，所以產(chǎn)出的酶量不同，因此可供深黃傘形霉利用的碳水化合物含量不同，油脂產(chǎn)量不同。如圖5所示，不同的孢齡的孢子，油脂產(chǎn)量隨時(shí)間變化趨勢(shì)基本一致，但油脂產(chǎn)量各不相同。孢齡7 d的孢子，發(fā)酵第一周的油脂產(chǎn)量高于9 d和11 d的，為最大值，這是因?yàn)殒啐g越小，其代謝愈加旺盛，產(chǎn)出的酶量也更多，所以油脂產(chǎn)量最高。而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同的孢齡的孢子油脂產(chǎn)量逐漸降低，其中孢齡11 d的油脂產(chǎn)量下降最快，這是因?yàn)槠渥陨泶x較為遲緩，生長(zhǎng)較慢，產(chǎn)出的酶量較少，油脂產(chǎn)量最低。因此選擇孢齡7 d的孢子進(jìn)行混合固態(tài)發(fā)酵最為合適。

圖5 不同孢齡對(duì)油脂產(chǎn)率的影響

2.5 最適條件下的油脂產(chǎn)量

不同的影響因素對(duì)于固態(tài)發(fā)酵積累油脂具有不同的影響，如圖6所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，油脂含量在0 d～7 d不斷升高，第7 d達(dá)到最高值，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，油脂含量不斷下降，因此固態(tài)發(fā)酵收獲油脂的最佳時(shí)間為7 d。并且通過對(duì)初始水分含量、接種孢子數(shù)量、兩種微生物孢子數(shù)比例和孢子的培養(yǎng)時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化可得，在最適培養(yǎng)條件下的油脂產(chǎn)量可達(dá)59.04 mg／（g麩皮），因此通過對(duì)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化可以獲得較高的油脂產(chǎn)量。

圖6 不同影響因素對(duì)油脂產(chǎn)量的影響

2.6 脂肪酸成分分析

氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀能夠?qū)虘B(tài)發(fā)酵得到的油脂成分進(jìn)行定性和定量分析，按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)接菌量為107CFU／g麩皮，初始水分含量為75%，孢齡為7 d，兩種菌比例1∶1的固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)油脂進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果見表1、表2和表3。

表2 微生物脂肪酸組成和含量實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

表3 四種油脂的主要脂肪酸分布表

表1中列出了通過氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀所測(cè)得的固態(tài)發(fā)酵油脂的主要脂肪酸成分，通過對(duì)深黃色孢霉積累的油脂成分分析可知，其脂肪酸主要成分與肉豆蔻酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、順-11-二十烯酸、花生酸等皆有良好的相關(guān)度。其中棕櫚油酸、亞油酸、油酸、順-11-二十烯酸為不飽和脂肪酸，具有降低血脂、軟化血管、降低血壓降低心臟疾病、中風(fēng)等風(fēng)險(xiǎn)的作用，并且在人和動(dòng)物的新陳代謝過程中也起著重要作用。此外，不飽和脂肪酸還可用來制造肥皂、乳化劑、靜電劑以及潤(rùn)滑柔軟劑。而肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸等為飽和脂肪酸，可用作硫化活性劑、潤(rùn)滑劑、脫模劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑以及塑料耐寒增塑劑，生產(chǎn)硬脂酸鹽、橡膠工業(yè)、塑料、紡織等工業(yè)制品，因此通過深黃傘形霉與黑曲霉進(jìn)行混合固態(tài)發(fā)酵積累油脂的途徑是可行的。

表1 深黃傘形霉油脂成分分析

表2為微生物脂肪酸組成和含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化結(jié)果。由表可知，雙菌固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的微生物油脂的主要脂肪酸為棕櫚酸、亞油酸、油酸和硬脂酸，且飽和脂肪酸含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)；而不飽和脂肪酸則相反，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵初期，不飽和脂肪酸的含量較高，飽和脂肪酸的含量較低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不飽和脂肪酸的含量在0～2周逐漸升高，第2周達(dá)到最高值49%，隨后2～6周逐漸下降，降至25%，而飽和脂肪酸的含量在0～4周先升高后逐漸降低，第4周達(dá)到最低值36%，隨后4～6周逐漸升高達(dá)到最高值57%。其中不飽和脂肪酸的各個(gè)主要組分的變化也盡不相同，如棕櫚油酸只在第1周存在，隨后逐漸降至為0；順-11-二十烯酸只在第6周存在，0～4周并不存在；亞油酸含量則在0～4周逐漸降低，4～6周短暫升高；油酸含量在0～4周逐漸升高，4～6周逐漸降低。而飽和脂肪酸中各個(gè)組分的變化也不同，如花生酸只在第1周存在；肉豆蔻酸含量為0～1周升高，1～2周降低，2～6周升高；棕櫚酸含量為1～2周升高，2～4周降低，4～6周升高，硬脂酸含量則表現(xiàn)為1～2周降低，2～4周升高，4～6周降低，因此可知在固態(tài)發(fā)酵過程中，脂肪酸的成分并不是一成不變，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同的脂肪酸含量亦會(huì)發(fā)生不同的變化。由表2可知，表中的脂肪酸所占總脂肪酸的比例隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升的變化。雖然培養(yǎng)后期表中脂肪酸所占比例增加至82%，但仍低于第1周的88%，且由圖1～圖4可知第1周的油脂含量最高，因此收獲油脂的最佳時(shí)間為1周。

通過將深黃傘形霉與黑曲霉固態(tài)發(fā)酵積累的油脂與不同來源的油脂成分分析對(duì)比。由表2可知，雙菌固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的微生物油脂的主要脂肪酸為棕櫚酸、亞油酸、油酸和硬脂酸。如表3所示，四種脂肪酸占總脂肪酸的77.43%，不飽和脂肪酸含量只占24%左右，低于動(dòng)物油（豬油）和植物油（大豆油和橄欖油）。其中棕櫚酸含量關(guān)系為固態(tài)發(fā)酵所得油脂＞豬油＞大豆油＞橄欖油；亞油酸含量關(guān)系為大豆油＞固態(tài)發(fā)酵所得油脂＞橄欖油＞豬油；油酸含量關(guān)系為橄欖油＞豬油＞大豆油＞固態(tài)發(fā)酵所得油脂；硬脂酸含量關(guān)系為豬油＞固態(tài)發(fā)酵所得油脂＞大豆油＞橄欖油；較其他三種油脂相比，固態(tài)發(fā)酵所得油脂油酸（11.2%）最低，硬脂酸（7.8%）含量低于豬油（19.8%）。與不同來源的油脂成分分析對(duì)比，雙菌固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的微生物油脂的主要脂肪酸為棕櫚酸、亞油酸和油酸，這三種脂肪酸成分含量接近于大豆油。因此，通過深黃傘形霉與黑曲霉固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的微生物油脂與植物油較為相近，與動(dòng)物油相比存在較大差別。

3 結(jié)論與討論

目前，大部分研究者致力于對(duì)深黃傘形霉的誘導(dǎo)突變以提高油脂的產(chǎn)量，誘導(dǎo)突變的常用方法有紫外照射、低能離子束、化學(xué)試劑誘導(dǎo)以及抗性篩選等方法。如劉勝男［22］通過氮離子反復(fù)誘變篩選獲得一株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)突變株F312，其γ-亞麻酸產(chǎn)量為1.2 g／L，比原始菌株（480 mg／L）提高了157.5%；而郝冉［23］通過紫外照射與抗性篩選，最終得到了一株具良好遺傳穩(wěn)定性的突變株，其GLA產(chǎn)量為889.8 mg／L，比原始菌株提高了60.3%。雖然通過誘導(dǎo)突變可以獲得高產(chǎn)量的突變菌株，但此方法具有很強(qiáng)的不確定性，因此并不能用于提高油脂產(chǎn)量的實(shí)際生產(chǎn)中。此外，部分研究者還致力于對(duì)深黃傘形霉培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)條件優(yōu)化以提高油脂產(chǎn)量。如張敏［24］首先對(duì)培養(yǎng)基中的葡萄糖、酵母膏和MgSO4進(jìn)行單因素優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基的不同組分，得到了深黃傘形霉產(chǎn)培養(yǎng)基的最佳配方，在此條件下油脂產(chǎn)量為12.0 g／L，比優(yōu)化前（6.2 g／L）提高了93.1%；SOMACAL［25］通過對(duì)酵母膏、蛋白胨和蔗糖三種不同培養(yǎng)基成分和三種發(fā)酵參數(shù)（攪拌速度、溫度和pH）的優(yōu)化分析，確定了250 mL搖瓶發(fā)酵的最佳生產(chǎn)條件，在此培養(yǎng)方式下，產(chǎn)脂率為31.77%，其中多不飽和脂肪酸含量為16.7%，而楊勇［26］通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化深黃傘形霉突變菌株發(fā)酵制備花生四烯酸工藝，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：接種量15.7%，發(fā)酵溫度28.29℃，發(fā)酵時(shí)間6.58 d，發(fā)酵pH 6.0，在此條件下花生四烯酸的產(chǎn)量為3.1 g／L。雖然優(yōu)化培養(yǎng)基配方以及培養(yǎng)條件可以一定程度提高油脂產(chǎn)量，但效果并不明顯，且此方法會(huì)增加成本，會(huì)造成資源的浪費(fèi)，因此并不能應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。深黃傘形霉雖然可以利用多種有機(jī)廢棄物原料轉(zhuǎn)化生成油脂，但是部分有機(jī)物在有機(jī)廢棄物轉(zhuǎn)化為油脂的過程中還會(huì)產(chǎn)生部分抑制物，如?ANTEK［27］通過研究木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解過程中會(huì)產(chǎn)生的不同毒性抑制劑，毒性最大的是酚類，其次是呋喃甲醛和脂肪酸。酚類化合物對(duì)深黃傘形霉生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累的抑制作用最強(qiáng)。而脂肪酸在低濃度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累，高濃度則強(qiáng)烈抑制這兩個(gè)過程。因此當(dāng)使用黑曲霉與深黃傘形霉進(jìn)行混合固態(tài)發(fā)酵時(shí)可以很好地解決這些問題，因?yàn)楹谇箍梢苑置诔鲚^多的復(fù)合酶將食品廢棄物水解成碳水化合物，不會(huì)生成抑制劑，不會(huì)對(duì)黑曲霉和深黃傘形霉生長(zhǎng)造成影響。

由于雙菌結(jié)合固態(tài)發(fā)酵的影響因素較多，如初始含水量、接菌量、接菌比例和接菌的孢齡等因素。因此通過對(duì)固態(tài)發(fā)酵的多個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化可得，固態(tài)發(fā)酵的最適初始水分含量為75%、最適接菌量為107CFU／g麩皮、最適孢齡為7 d、最適菌種比例為黑曲霉∶深黃傘形霉＝1∶1，在此條件下可獲得較高的油脂產(chǎn)量，為59.04 mg／（g麩皮）。其中所得油脂中的脂肪酸以棕櫚酸（45.4%）、亞油酸（13.0%）、油酸（11.2%）和硬脂酸（7.8%）為主。雖然不同的發(fā)酵條件下油脂產(chǎn)量不同，但油脂產(chǎn)量幾乎均呈現(xiàn)相同的降低趨勢(shì)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)油脂含量不斷下降，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，固態(tài)發(fā)酵過程面臨菌種退化、營(yíng)養(yǎng)原料不足以及代謝產(chǎn)物的抑制問題，因此為了提高油脂產(chǎn)量必須對(duì)這些問題予以解決。雖然采用基因工程手段提高深黃傘形霉纖維素酶類的產(chǎn)量也是一個(gè)技術(shù)上可行的措施，但由于廢棄物的成分復(fù)雜需要很多種酶來協(xié)同作用，需要深黃傘形霉表達(dá)多種酶。這樣就增加了技術(shù)難度，重組后深黃傘形霉的安全性也有待于重新評(píng)估。因此未來可以通過對(duì)黑曲霉菌株進(jìn)行改造以及營(yíng)養(yǎng)原料的改變以提高油脂產(chǎn)量，因?yàn)楹谇故鞘称钒踩粤己玫墓I(yè)菌株，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于淀粉加工、飲料、檸檬酸等食品物質(zhì)的生產(chǎn)。通過對(duì)黑曲霉控制多種酶的基因進(jìn)行改造，可以提高復(fù)合酶的產(chǎn)量，進(jìn)而提高黑曲霉的水解麩皮的能力，提高黑曲霉與深黃傘形霉固態(tài)發(fā)酵的油脂產(chǎn)量。并且混合培養(yǎng)固態(tài)發(fā)酵不僅有利于絲狀真菌的生長(zhǎng)和酶的分泌，也有利于絲狀真菌在基質(zhì)上的附著和對(duì)基質(zhì)的滲透，因此通過此方法提高油脂產(chǎn)量是可行的。而且還可通過添加不同的食品廢棄原料以及改變不同的食品廢棄物原料配比提高油脂產(chǎn)量，因?yàn)楦淖兪称窂U棄物原料配比篩選出最適的食品廢棄物原料配比體系，促進(jìn)食品廢棄物中糖的釋放，進(jìn)而提高食品廢棄物的利用率，為深黃傘形霉積累油脂提高足夠的原料。此外，轉(zhuǎn)化過程中由于菌株代謝會(huì)產(chǎn)生部分抑制物抑制菌株的生長(zhǎng)，可通過對(duì)轉(zhuǎn)化過程中的抑制物去除以提升菌株的活力進(jìn)而提高固態(tài)發(fā)酵過程中的油脂產(chǎn)量。因此可通過這些途徑進(jìn)一步提高油脂產(chǎn)量，為食品廢棄物資源的轉(zhuǎn)化以及可再生能源的研究提供參考。