工業(yè)分枝桿菌甾醇代謝基因組學(xué)的研究進(jìn)展

黃莎莎， 蘇正定

工業(yè)發(fā)酵教育部重點實驗室和湖北省工業(yè)微生物重點實驗室湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068

甾體（steroids）是一類結(jié)構(gòu)非常特殊的天然產(chǎn)物，其分子母體結(jié)構(gòu)中都含有環(huán)戊烷并多氫菲（cyclopentano-perhydrophenanthrene）碳骨架，此骨架又稱甾核（steroid nucleus）。甾體化合物又稱為類固醇，屬于脂類的一種，自然界中有上千種甾類物質(zhì)，存在于動、植物及某些微生物細(xì)胞中。甾體類藥物在臨床上具有廣泛的應(yīng)用，為僅次于抗生素的第二大類藥物。目前工業(yè)上主要利用分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇制備甾體藥物起始和中間體原料。目前，人們已對分枝桿菌甾體降解途徑中的許多關(guān)鍵酶進(jìn)行了研究，但對降解途徑尚未完全了解。近年來，工業(yè)微生物分枝桿菌甾體降解途徑基因組分析的重要性引起廣泛的注意。為了更深入地了解甾體降解途徑，本文介紹了分枝桿菌基因組學(xué)、代謝組學(xué)的研究進(jìn)展。

1 甾類化合物簡介

甾類化合物是一類特殊的多元環(huán)萜化合物，結(jié)構(gòu)上由（A、B、C）三個完整封閉的六元環(huán)和一個五元環(huán)（D）的環(huán)戊烷多氫菲及一些官能取代基組成。甾類化合物包括甾醇、膽汁酸、維生素D、神經(jīng)甾體以及類固醇激素等，具有重要的生理醫(yī)藥功能［1-2］，如腎上腺皮質(zhì)激素具有抗炎癥等功效。甾類化合物市場需求大，利用微生物法制備甾類化合物的工藝具有環(huán)境污染小、專一性較強(qiáng)、反應(yīng)步驟少、產(chǎn)品回收率高等優(yōu)點［3，35］。眾多微生物菌屬中分枝桿菌能夠降解甾醇轉(zhuǎn)化關(guān)鍵甾類藥物中間體4-雄烯二酮（4-Androstene-3，17-dione，4-AD）、1，4-雄烯二酮（Androsta-1，4-diene-3，17-dione，ADD）、雄甾醇-4-烯-3，17-二酮（9-Hydroxy-4-androstene-3，17-dione，9-OH-AD）。

2 分枝桿菌概況及分解植物甾醇體

分枝桿菌（Mycobacterium sp.）屬于放線菌目，是一類細(xì)長略帶彎曲的桿菌，有分枝桿菌生長趨勢，可分為三組：結(jié)核桿菌、非結(jié)核桿菌與麻風(fēng)桿菌；結(jié)核桿菌和麻風(fēng)桿菌以危害嚴(yán)重的傳染性病原菌聞名，多年來是醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點。截至2021年6月為止，Genome Online database數(shù)據(jù)庫中共記錄了244株分枝桿菌的全基因組測序信息，其中完成測序的為216株，正在測序的有25株，計劃測序的有1株，針對性測序的有1例（https：／／www.genomesonline.com）。

非致病型分枝桿菌是常用的工業(yè)菌株，具有眾多分枝桿菌的重要生理特征，例如該菌細(xì)胞壁含有大量的脂質(zhì)影響甾醇轉(zhuǎn)化活性，主要成分為分支菌酸等［4-5］，其中以膽固醇營養(yǎng)物質(zhì)等甾醇為唯一碳源并開環(huán)降解為自身提供能量。2008年P(guān)ANDEY等研究中［6］證實結(jié)核桿菌降解膽固醇并從中獲取能源和能源化合物，結(jié)核分枝桿菌維持較慢的感染能力與它獲得膽固醇的能力密切相關(guān)，也是造成肺結(jié)核長時間不愈的重要原因［7］。但是，分枝桿菌降解膽固醇的能力也有其利用價值的一面，即分枝桿菌可轉(zhuǎn)化膽固醇等天然植物甾醇生成系列代謝中間體和藥物前體，因而具有重要應(yīng)用價值。1944年TURFITT等［8］等發(fā)現(xiàn)分枝桿菌可完全降解代謝膽固醇側(cè)鏈和骨架；1972年MARSHECK等［9］利用不需要添加抑制劑的誘變選育方法得到了分枝桿菌NRRL B-3805，能有效轉(zhuǎn)化4AD為睪酮，轉(zhuǎn)化ADD成為AD，從而奠定了分枝桿菌降解甾醇工業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)。

多種可降解甾類的微生物菌屬中，其中以紅球菌屬與分枝桿菌屬代謝能力受到最為廣泛的關(guān)注，利用誘變選育可作為積累甾藥中間體AD等的重要微生物工廠［1，10-14］。紅球菌曾經(jīng)很長一段時間被認(rèn)為是紫紅分枝桿菌，直到1978年才正式承認(rèn)紅球菌這個屬名，是介于分枝桿菌與諾卡氏菌Nocardia之間的一類微生物，具有好氧、革蘭氏陽性、多形態(tài)菌、菌落粗糙與分枝桿菌類似的特點［15］。紅球菌屬與分枝桿菌屬微生物都適用于甾類藥物中間體的生產(chǎn)；它們細(xì)胞壁產(chǎn)生的表面活性劑有親水和疏水兩種基團(tuán)，能在水相和油相移動，提高細(xì)胞的耐受力，適用于油水兩相體系發(fā)酵及促進(jìn)分枝桿菌對甾體化合物底物的攝?。?6-18］，擁有完善的甾類降解基因簇、種類豐富的特異性加氧酶、氧化還原酶以及β-氧化酶、確保了微生物對底物的快速代謝［19-22，32］；多數(shù)紅球菌屬與分枝桿菌具有快速生長特點，易培養(yǎng)繁殖，是理想的甾類生物轉(zhuǎn)化媒介。

3 分枝桿菌基因?qū)W

自1998年第一個分枝桿菌的M．tuberulosis H37Rv全基因組［23］發(fā)布以來，越來越多的研究機(jī)構(gòu)對不同分枝桿菌進(jìn)行了全基因組測序，分析其基因組特征，不斷解析和完善分枝桿菌甾醇降解代謝途徑的各個關(guān)鍵酶基因功能，初步繪制甾醇代謝圖譜，闡明代謝機(jī)制及明確降解機(jī)制［33-34］。截至目前為止，多數(shù)典型分枝桿菌已經(jīng)完成全基因組測序（表1）［24］，部分進(jìn)行了甾醇關(guān)鍵酶的活性測定。通過對不同分枝桿菌進(jìn)行基因組分析，研究發(fā)現(xiàn)分枝桿菌甾體代謝相關(guān)基因聚集成簇。GRIFFIN［25］等在對M．tuberulosis H37Rv高通量測序發(fā)現(xiàn)攝取甾醇過程中起作用的基因很多，約60%的重要基因位于簇外的基因組其他位置，因此給系統(tǒng)性研究分枝桿菌代謝途徑帶來極大的挑戰(zhàn)。除此之外，一些快速生長型分枝桿菌中廣泛存在的同工酶序列與模糊功能基因，也給甾醇降解機(jī)制的解析與甾藥工程菌的開發(fā)構(gòu)建增加了難度［19，26］。

表1 完成測序的典型甾類代謝微生物

2010年魏?。?7］等以M．neoaurum NWIB-01為菌種，以質(zhì)粒為載體對該菌株進(jìn)行Fosmid單克隆基因組測序，通過基因標(biāo)簽的PCR篩選及測序的方法，得到部分的基因簇序列片段約81 kb，發(fā)現(xiàn)很多甾醇代謝關(guān)鍵酶。關(guān)鍵酶基因ksdd、ksha、kshb的序列分別為1056 bp、1701 bp、1188 bp。由于分枝桿菌基因組復(fù)雜的特殊結(jié)構(gòu)以及有限的測序技術(shù)條件，這些先導(dǎo)性基因組學(xué)研究難以拼接完整的基因簇，可能錯失一些重要的起調(diào)控作用基因的信息。

2014年，姚抗［28］對M．neoaurum ATCC 25795全基因組進(jìn)行了測序和分析，結(jié)合基因組測序的重要信息，對代謝通路分子的認(rèn)識，分別得出三種關(guān)鍵代謝酶，兩個編碼CHO的基因choM1（編碼1746 bp，完整編碼581個氨基酸）與choM2（編碼1617 bp，編碼538個氨基酸）以及一個編碼3β-HSD（編碼1065 bp，編碼354個氨基酸）基因；編碼KstD的基因MN-ksD1（編碼1701 bp，編碼566個氨基酸）、基因MN-ksD2（編碼1677 bp，編碼558個氨基酸）及基因MN-ksD3（編碼1548 bp，編碼515個氨基酸），編碼KSH的基因還原酶MN-KshB（編碼1 069 bp基，編碼351個氨基酸）及加氧酶MN-KshA（編碼1 188 bp，編碼395個氨基酸）。

2017年，徐玲霞［29］等通過Illumina高通量測序技術(shù)對M．neoaurum MN4和M．neoaurum MN2進(jìn)行全基因組測序，采用NGSQCTool kit軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，再通過Velvet軟件對過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，基因組序列如下特點：

M．neoaurum MN4基因組大小為539.053 bp，其基因組共包含5 049個基因，46個tRNA，3個（5 s-16 s-23 s）rRNA；4920編碼序列，其中992個CDS編碼保守的假定蛋白，3 684個CDS編碼具有明確功能的產(chǎn)物；編碼序列占整個基因組的90.6%，平均長度為992，GC含量為66.9%，假基因個數(shù)為325個。

M．neoaurum MN2基因組的大小為538.301bp，其基因組包含5 049個基因，46個tRNA，3個（5 s-16 s-23 s）rRNA，4 890個編碼序列；其中1 435個CDS編碼保守的假定蛋白，3455個CDS編碼具有明確功能的產(chǎn)物；編碼序列占整個基因組的89.8%，平均長度為989，GC含量為66.8%，假基因個數(shù)為105個。

通過對兩株菌進(jìn)行基因組進(jìn)行分析分別得到16條和17條次級代謝產(chǎn)物基因簇，在MN2菌株中發(fā)現(xiàn)與甾醇提取相關(guān)基因choM1、choM2、3βhsd，MN4中發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因choM1、choM2、3β-hsd以及Kstd-1、Kstd-2、KstA-1、KstB。

2018年，本實驗室對分枝桿菌M．neoaurum HGMS2進(jìn)行全基因組測序［30］，發(fā)現(xiàn)其基因組中含有1條染色體，基因組總長度為5 421 383 bp，5 133個基因，占基因組的92.10%。含有5 078個具有編碼功能的編碼序列，5 001個編碼基因，77個假定基因，55個RNA，6個rRNA（2個5S，2個16S，2個23S），46個tRNAs，3個ncRNA。菌株HGMS2基因組圈圖如圖1所示。

圖1 菌株HGMS2基因組圈圖

以NRRL B-3805為參考基因，發(fā)現(xiàn)菌株M．neoaurum HGMS2多出512個堿基對，無插入突變，32個缺失突變和6個位于編碼序列區(qū)域的Indel?；谠摼耆蚪M序列得到編碼三種關(guān)鍵酶的六個基因，分別為：編碼3-甾酮-1，2脫氫酶的基因KsdD211為1 692 bp、9α-羥化酶的基因KshA226約為1 185 bp、基因KshA395約為1 149 bp、基因KshB122約為1 056 bp、編碼末端碳單氧化酶的基因Mono164約為1 254 bp和基因Mono1973約為1 275 bp。通過基因組信息，預(yù)測了三種膽固醇氧化酶（ChoM組1：ChoM1、ChoM2和hsd），兩種單加氧酶（Mon組2：Mon164和Mon197），一組側(cè)鏈降解酶，一組3-酮甾體-1，2-脫氫酶（KstD；組4：KstD211）和3個3-酮甾體-9a-羥化酶（Ksh；組5：KshA226、KshA395和KshB122）。一個編碼Mon164、KstD211、KshA226、KshB122和β脂肪酸的基因簇，共同參與M．neoaurum HGMS2中的植物甾醇降解途徑。

ASMAR［31］等2014年對分枝桿菌M．DSM 44074菌株進(jìn)行了基因組測序，其基因編碼量為5 112 765 bp，（編碼率為92.35%，共鑒定出5 274個基因，其中239個（4.53%）編碼假定蛋白，822個（15.59%）編碼假定蛋白。此外，5 220個基因在COG數(shù)據(jù)庫中至少匹配一個序列。

4 分枝桿菌的甾醇代謝組學(xué)

研究發(fā)現(xiàn)分枝桿菌可降解甾醇類物質(zhì)并將其作為碳源，先降解甾醇的側(cè)鏈，其次多步催化反應(yīng)降解為二氧化碳和水。如新金分枝桿菌轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)AD、ADD、9-OH-AD、1，4-HBC、4-HBC等甾體藥物中間體。甾醇轉(zhuǎn)化過程中由于代謝分支多，步驟長?；诨蚪M學(xué)獲得分枝桿菌的關(guān)鍵基因簇序列，針對代謝途徑中的關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除改造微生物分枝桿菌，轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)AD、ADD、9-OH-AD、1，4-HBC和4-HBC等甾體藥物中間體代謝產(chǎn)物，采用LC-MS、TLC、HPLC等代謝組學(xué)技術(shù)定性定量的方法，分析這些菌株甾醇轉(zhuǎn)化代謝途徑及組分，確定對應(yīng)的關(guān)鍵酶是否調(diào)控植物甾醇代謝途徑。

魏?。?7］等對利用NI＋親和層析柱分別得到產(chǎn)物3-甾酮-△1-脫氫酶，3-Ketosteroid-9α-羥化酶還原酶。分別通過對野生菌型及KSdD基因敲除菌進(jìn)行植物甾醇轉(zhuǎn)化進(jìn)行實驗，采用基于高分辨質(zhì)譜平臺的非靶向代謝組學(xué)方法得到野生菌主要積累ADD而KSdD基因敲除菌主要積累AD，證實KSdD是AD到ADD轉(zhuǎn)化的主要酶。

姚抗［28］等通過敲除同工酶的編碼基因，構(gòu)建六株不同的工業(yè)分枝桿菌，分析目標(biāo)基因在不同底物誘導(dǎo)時的轉(zhuǎn)錄差異，利用代謝組學(xué)證實這些酶在分枝桿菌中的甾醇代謝功能。通過出發(fā)菌株M．neoaurum ATCC 257795的基因組信息分析，鑒定出編碼Kstd的基因，構(gòu)建9-OHAD高效生產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)化植物甾醇，運用GC-MS技術(shù)分析MN-Kstd敲除菌中生成的未知代謝產(chǎn)物，得出3-甾酮-△1-脫氫酶（Kstds）是催化9-OHAD轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定中間體9-OHADD反應(yīng)的關(guān)鍵酶。運用TLC、HPLC及LC／MS技術(shù)對MN-kshA敲除菌代謝產(chǎn)物分析得到MN-KshA1為KSH的關(guān)鍵加氧酶，對9α-羥基化過程起著無可替代的意義。

徐玲霞［29］等基于分枝桿菌M．neoaurum MN2和MN4全基因信息測序進(jìn)行甾醇降解關(guān)鍵基因簇分析，通過HPLC技術(shù)分析MN2和MN4植物甾醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物得到代謝基因突變導(dǎo)致突變株MN2能夠耐受高底物的植物甾醇使得其AD與ADD的比例為13∶1，MN4中轉(zhuǎn)成AD與ADD的比例為20∶1。

WANG［30］等基于分枝桿菌Mycobacterium neoaurum sp HGMS2基因組的分析，鑒定出轉(zhuǎn)化植物甾醇關(guān)鍵基因，利用TLC技術(shù)驗證KshD基因表達(dá)的產(chǎn)物酶的活性；HPLC技術(shù)分析得到9α-羥基化酶基因編碼的蛋白KsnA395、KsnB122有活性，KsnA266無活性。

5 展望

分枝桿菌對甾醇體的代謝有很好的生物轉(zhuǎn)化功能，近幾年對分枝桿菌不同菌株進(jìn)行基因組測序，深度挖掘測序數(shù)據(jù)去發(fā)現(xiàn)其代謝通路關(guān)鍵酶基因，探索其關(guān)鍵基因功能。推測關(guān)鍵酶在分枝桿菌的代謝途徑的分解機(jī)制，通過分析其代謝組學(xué)，提高甾體藥物中間體的產(chǎn)量。分枝桿菌甾醇降解分子機(jī)制的相關(guān)研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)還不夠，還需要對分枝桿菌降解甾醇的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行深入的研究。相信隨著微生物代謝甾體的機(jī)制及其功能簇基因不斷被揭示，微生物轉(zhuǎn)化法在甾體藥物的生產(chǎn)中將發(fā)揮越來越重要的作用。