瑞戈非尼通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路調(diào)控肝癌進(jìn)展的分子機(jī)制

陳建南 吳進(jìn)盛 于莉 余華軍

(1儋州市人民醫(yī)院藥劑科，海南 儋州 571700；2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤姑息治療科)

肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌的主要形式，由于其5年生存率較低，是導(dǎo)致肝癌死亡的第二大原因〔1〕。肝細(xì)胞癌作占世界范圍內(nèi)總肝癌病例的70%～85%〔2〕。世界范圍內(nèi)每年新診斷的肝癌的患者超過(guò)780 000例〔3〕。肝細(xì)胞癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展依賴于遺傳、環(huán)境和生活方式因素之間復(fù)雜的相互作用〔4〕。肝細(xì)胞癌通常發(fā)生在慢性肝損傷的環(huán)境中，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥、肝細(xì)胞再生、肝基質(zhì)重構(gòu)、纖維化和肝硬化，其中肝硬化是肝細(xì)胞癌最重要的危險(xiǎn)因素〔5〕。

目前肝細(xì)胞癌的治療方案包括肝部分切除、肝移植和局部區(qū)域治療〔6〕。對(duì)于無(wú)法再獲得治療的晚期肝細(xì)胞癌患者多激酶抑制劑索拉非尼是一線治療藥物，其可以較好地維持肝臟功能〔7〕。然而，對(duì)于臨床上索拉非尼耐藥的患者，在瑞戈非尼被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)前，一直沒有有效的治療方案〔8〕。瑞戈非尼作為一種多靶點(diǎn)激酶抑制劑，主要適用于先前接受索拉非尼治療且耐藥的肝細(xì)胞癌患者〔9〕。瑞戈非尼是首個(gè)也是唯一一個(gè)能夠顯著改善肝細(xì)胞癌患者總生存期的二線治療藥物〔10〕。對(duì)于多吉美治療期間疾病出現(xiàn)進(jìn)展的肝細(xì)胞癌患者，在接受瑞戈非尼治療后，總生存期得到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和臨床意義的改善〔11〕。

Wnt信號(hào)通路在進(jìn)化中高度保守，普遍存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及死亡，在維持機(jī)體正常生長(zhǎng)和代謝等方面發(fā)揮重要作用〔12〕。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路包括蓬亂蛋白受體家族的激活及β-catenin在細(xì)胞核中水平上調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖。目前眾多癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了Wnt信號(hào)持續(xù)活化〔13〕，其中，Wnt信號(hào)通路的失控與肝細(xì)胞癌的發(fā)生亦密切相關(guān)〔14〕，瑞戈非尼作為首個(gè)獲批用于肝細(xì)胞癌的二線治療的新藥，瑞戈非尼的靶點(diǎn)包括c-RAF、突變型b-RAF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體等生長(zhǎng)信號(hào)和血管生成因子反應(yīng)的重要中介〔10〕。由于Wnt信號(hào)通路在肝細(xì)胞癌中異常激活，本研究旨在探究瑞戈非尼處理是否可通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路而發(fā)揮抗癌作用。

1 材料和方法

1.1試劑和材料 瑞戈非尼由拜耳公司(大中華區(qū))提供，雄性野生型C57BL/6小鼠購(gòu)買自上海斯萊克生物有限公司，二乙基亞硝胺(DEN，貨號(hào)：N0725) 和青/鏈霉素(貨號(hào)：N03294)自Sigma Aldrich公司，小鼠飼料(貨號(hào)：D12450Bi)購(gòu)買自Research diet公司，β-catenin抗體(貨號(hào)：AB30482)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β抗體(貨號(hào)：AB11291)、重組蛋白A/G-瓊脂糖凝膠珠(貨號(hào)：D39492)購(gòu)買自上海煊翎生物有限公司。

1.2小鼠肝癌模型的構(gòu)建 雄性野生型C57BL/6小鼠飼養(yǎng)在(23±3)℃，濕度35%±5%，12 h/12 h的暗/光循環(huán)的房間里(早上6∶30開燈)，自由進(jìn)水和飼料。肝癌模型是在4周齡野生型C57BL/6小鼠的腹腔注射25 mg/kg的DEN溶液，對(duì)照組注射同劑量的生理鹽水，每組20只，1次/w，連續(xù)注射4 w，然后小鼠正常飼料連續(xù)飼養(yǎng)24 w。

1.3瑞戈非尼藥物處理 在DEN處理20 w后，將對(duì)照組和肝癌模型組隨機(jī)分為2個(gè)亞組，每組10只，即對(duì)照組，瑞戈非尼處理組，肝癌模型組，肝癌瑞戈非尼處理組4組，其中瑞戈非尼處理組、肝癌瑞戈非尼處理組每天灌胃給予瑞戈非尼10 mg/kg，對(duì)照組給予同體積的生理鹽水，每天給藥一次，連續(xù)給藥4 w。給藥期間，定期檢測(cè)小鼠體重。給藥結(jié)束后1%戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，小鼠心尖取血，取出肝臟，稱量肝臟重量，測(cè)量腫瘤相關(guān)參數(shù)，并將肝臟組織取材后立即放入液氮冷凍，然后放入-80℃保存。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

1.4檢測(cè)腫瘤相關(guān)參數(shù) 計(jì)數(shù)肝臟中腫瘤的數(shù)量，用游標(biāo)卡尺測(cè)量不同腫瘤結(jié)節(jié)的最長(zhǎng)直徑并統(tǒng)計(jì)不同直徑腫瘤的數(shù)量，測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)直徑和最短直徑及腫瘤的高度，根據(jù)V=長(zhǎng)×寬×高×π/6計(jì)算腫瘤的體積，并統(tǒng)計(jì)4組之間的腫瘤相關(guān)指數(shù)的差異。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 用4%多聚甲醛固定液固定肝臟組織，樣品脫水處理，石蠟浸蠟包埋，然后切片，用石蠟切片進(jìn)行HE染色，經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟和不同濃度乙醇水化，蘇木素染色液染色5 min，沖洗去多余的染色液，伊紅染色液染色30 s，脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察拍照，觀察各組小鼠肝臟組織的基本形態(tài)。

1.6免疫組化染色 石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟和不同濃度乙醇水化，然后高溫加熱抗原修復(fù)，山羊血清封閉液，室溫封閉30 min，加入β-catenin抗體，室溫靜置2 h，然后加入二抗，室溫靜置1 h，蘇木素復(fù)染30 s，脫水透明最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果，觀察β-catenin在各組小鼠肝臟切片中的表達(dá)量。

1.7Realtime PCR技術(shù) 提取總RNA，Trizol室溫裂解細(xì)胞，氯仿分離去除蛋白，取水相加入異丙醇萃取RNA沉淀，用75%酒精(DEPC水配制)洗滌沉淀，晾干殘留乙醇，將沉淀溶于適量DEPC水中，檢測(cè)RNA純度及濃度。用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。使用Applied Biosystems公司的SYBR Green PCR system，以actin為內(nèi)參，進(jìn)行基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)比較相關(guān)基因表達(dá)差異。

所使用的引物合成于上海生工有限公司，序列如下：小鼠actin：正向 5′-AGCTCGATCGATCGCTCG-3′，反向 5′-GTCTCGTCGCTCGCTATCTGG-3′；小鼠β-catenin：正向 5′-CAGCGCTGTCGCTGCAG-3′，反向 5′-ACGCTGCTAACCACCGCCTCTGG-3′；小鼠G1/S-特異性周期蛋白(cyclin)D1：正向 5′-ATATGTGTCGATGTGA-3′，反向 5′-ACCCCTCGCTCGCTA-GACCA-3′；小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9：正向 5′-ACACCGTCGTGACGGTTC-3′，反向 5′-CCG-GGCTGAATCCCGGACAAT-3′。

1.8CO-IP技術(shù) 肝臟組織用研磨儀在添加了蛋白酶抑制劑的CO-IP裂解液裂解，置于冰上30 min后，4℃，20 000 r/min離心15 min，收集上清，每個(gè)IP反應(yīng)中加入2 μg GSK-3β抗體，4℃溫和旋轉(zhuǎn)2 h。然后加入蛋白G/A 瓊脂糖凝膠珠使其終濃度為2.5%(V/V)，4℃旋轉(zhuǎn)2 h。4℃，3 000 r/min離心3 min收集瓊脂糖凝膠珠，并用IP洗液洗3次。洗后的珠子加入SDS上樣緩沖液并煮沸10 min，隨后12 000 r/min，室溫離心5 min，上清用于免疫印跡檢測(cè)，檢測(cè)GSK-3β和β-catenin的蛋白結(jié)合水平。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Graphpad Prism6.0軟件進(jìn)行two-way ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠狀態(tài)及體重的變化 4組小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未出現(xiàn)死亡。表1小鼠體重監(jiān)測(cè)表可以看出，DEN處理的肝癌模型組給藥8 w后體重明顯低于對(duì)照組(P<0.001)，且給予瑞戈非尼干預(yù)后，肝癌瑞戈非尼處理組小鼠體重開始緩慢上漲，肝癌瑞戈非尼處理組體重明顯高于肝癌模型組(P<0.01)。

2.2腫瘤相關(guān)指標(biāo)比較 肝癌模型組的肝臟重量/體重比，肝臟腫瘤數(shù)量，腫瘤的最大直徑及最大腫瘤體積均顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。肝癌瑞戈非尼處理組的肝臟重量/體重比，肝臟腫瘤數(shù)量，腫瘤最大直徑及最大腫瘤體積均顯著低于肝癌模型組(P<0.01)。見表2。

2.3各組肝臟HE染色 對(duì)照組和單純的瑞戈非尼處理組肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，可以看到肝小葉輪廓清楚完整，肝細(xì)胞索排列整齊，肝竇清晰可見，未有顯著的增生和凋亡現(xiàn)象。肝癌模型組可以看到肝癌組織排成細(xì)梁狀的假小葉狀結(jié)構(gòu)，癌細(xì)胞呈多邊形，體積明顯增大，核質(zhì)比增大，核染色加深，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)。而給予瑞戈非尼處理后，肝癌組織體積變小，癌細(xì)胞形狀較肝癌模型組略規(guī)，部分細(xì)梁狀排列，假小葉狀結(jié)構(gòu)較肝癌模型組減少。見圖1。

表1 各組體重監(jiān)測(cè)

表2 各組腫瘤相關(guān)指標(biāo)及cyclinD1、MMP9表達(dá)比較

2.4各組肝臟Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá) 瑞戈非尼可顯著逆轉(zhuǎn)肝癌組織中cyclinD1、MMP9的高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.5各組肝臟組織中β-catenin的亞細(xì)胞定位 對(duì)照組和瑞戈非尼處理組β-catenin主要是分布于細(xì)胞質(zhì)，且在肝臟組織中表達(dá)較少。與對(duì)照組比較，肝癌模型組組織中β-catenin的表達(dá)水平顯著升高(1.02±0.13 vs 2.65±0.43，P<0.01)，且β-catenin以核內(nèi)分布為主。與肝癌模型組比較，當(dāng)給予瑞戈非尼處理后，小鼠肝癌組織中β-catenin明顯減少(1.45±0.27，P<0.05)，見圖2。

2.6瑞戈非尼調(diào)控β-catenin和GSK3β的結(jié)合 與對(duì)照組比較，肝癌模型組小鼠肝臟中GSK-3β和β-catenin蛋白的相互作用減弱(1.13±0.21 vs 0.47±0.13;P<0.05)，β-catenin蛋白增加進(jìn)而入核增加；而給予瑞戈非尼后，相較于肝癌模型組GSK-3β和β-catenin蛋白表達(dá)明顯增加(2.14±0.58，P<0.001)，見圖3。

圖1 小鼠肝臟HE染色

圖2 各組肝臟β-catenin的表達(dá)及定位(免疫組化)

1～4：對(duì)照組、瑞戈非尼處理組、肝癌模型組、肝癌瑞戈非尼處理組圖3 瑞戈非尼對(duì)β-catenin和GSK-3β結(jié)合的調(diào)控

3 討 論

近年來(lái)，我國(guó)肝癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，復(fù)發(fā)率較高。傳統(tǒng)的輔助治療、放療和化療研究進(jìn)展緩慢，嚴(yán)重影響肝癌患者的生存率，因此尋找更有效的靶向藥物勢(shì)在必行〔2，3〕。越來(lái)越多的研究表明，肝細(xì)胞癌的發(fā)生與癌基因的過(guò)表達(dá)和腫瘤微環(huán)境有關(guān)〔15〕。目前在體研究顯示瑞戈非尼可抑制腫瘤發(fā)生，腫瘤血管生成，轉(zhuǎn)移和腫瘤免疫〔16〕。此外瑞戈非尼作用于腫瘤細(xì)胞中的多個(gè)激酶包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1～3、血管生成素受體2、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、原癌激酶等，通過(guò)抑制腫瘤微環(huán)境抑制腫瘤血管生成〔17〕。

Wnt/β-catenin通路與肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和侵襲密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Wnt/β-catenin通路的異常激活在肝癌腫瘤進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用。Wnt蛋白質(zhì)結(jié)合跨膜受體(Fizzled)，激活經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑，Wnt信號(hào)的激活可以抑制β-catenin“蛋白降解復(fù)合體”的形成，β-catenin不再進(jìn)入降解途徑而是轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)累積，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族相互作用從而激活特定基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如cyclinD1、MMP9的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移〔18，19〕。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)瑞戈非尼處理可改善肝癌小鼠的體重，減少肝臟腫瘤數(shù)量，腫瘤的最大直徑及最大腫瘤的體積。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示瑞戈非尼對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖及活性具有顯著的抑制作用。分子水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)瑞戈非尼主要通過(guò)促進(jìn)GSK-3β和β-catenin的蛋白相互作用，促進(jìn)β-catenin降解復(fù)合體的形成，抑制肝癌組織細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的累積，逆轉(zhuǎn)肝癌組織中cyclinD1、MMP9的高表達(dá)，最終抑制肝臟癌細(xì)胞的增殖和侵襲。據(jù)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，導(dǎo)致肝臟癌細(xì)胞的遷移、轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)和免疫逃逸〔18〕。

綜上，肝細(xì)胞癌組織中的Wnt/β-catenin通路過(guò)度激活是肝細(xì)胞癌預(yù)后不良的標(biāo)志之一。抑制Wnt/β-catenin通路的過(guò)度激活是瑞戈非尼治療肝細(xì)胞癌的一個(gè)重要靶點(diǎn)。瑞戈非尼負(fù)性調(diào)控肝細(xì)胞癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活抑制細(xì)胞增殖和侵襲。這一發(fā)現(xiàn)為瑞戈非尼的抗癌機(jī)制提供了一個(gè)新的理論依據(jù)，同時(shí)也證實(shí)了肝癌的治療靶點(diǎn)Wnt/β-catenin通路在肝細(xì)胞癌發(fā)病中的重要作用。