高糖環(huán)境下BCA-1通過Erk信號通路促進人脂肪間充質(zhì)干細胞增殖和遷移

王璐璐 李永濤 孫石柱 姚立杰 金海峰 張善強 沈雷

(1齊齊哈爾醫(yī)學院基礎醫(yī)學院解剖學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2汕頭大學醫(yī)學院粵北人民醫(yī)院醫(yī)學研究中心)

隨著生活習慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病已經(jīng)成為影響社會進步的重要慢性病。長期高血糖狀態(tài)會引發(fā)視網(wǎng)膜、皮膚、心臟等器官出現(xiàn)黃斑變性、糖尿病足、糖尿病心臟病等多種糖尿病性并發(fā)癥〔1〕。間充質(zhì)干細胞(MSC)具備多分化、低免疫力等特性，能夠很好修復神經(jīng)組織、骨軟骨、肌肉、血管等多種組織損傷〔2〕。高血糖環(huán)境產(chǎn)生氧自由基等物質(zhì)抑制呼吸鏈傳遞或能量代謝而損傷MSC、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等多種宿主細胞〔3〕。來源廣泛的脂肪(hAd)MSC是用于再生修復作用理想的“首選細胞”〔4〕。如果提高hAdMSC定向遷移到局部組織的能力，將提高hAdMSC分化，促進組織損傷修復。

B細胞趨化因子(BCA)-1，又稱趨化因子(CXCL)-13在胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、前列腺等腫瘤中促進癌細胞增殖，抑制腫瘤免疫〔5〕，在惡性腫瘤、炎癥等疾病發(fā)展過程中起到關鍵作用。MSC也具有很低免疫原性，可以逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，在細胞移植中較好避免了排斥反應，提示MSC可能具有BCA-1作用的相關靶點〔6〕，BCA-1可以作用于骨髓(B)MSC多個靶點，并能夠激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路促進BMSC旁分泌表皮生長因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白，提高BMSC增殖和遷移，抑制BMSC凋亡〔7〕，提示BCA-1對MSC也發(fā)揮了逃避免疫的作用，在多發(fā)性骨髓瘤等疾病的發(fā)生過程中起到重要作用。BCA-1結(jié)合于C-X-C型趨化因子(CXCR)5，下調(diào)miR-23a促進大鼠BMSC RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、堿性磷酸酶(ALP)等成骨細胞標志物高表達〔8〕。雖然BCA-1促進缺氧狀態(tài)人BMSC增殖過程〔9〕，但是在模擬糖尿病患者的體外高糖條件下，BCA-1對人hAdMSC的影響還要進一步了解。本文探討高糖環(huán)境下BCA-1對hAdMSC增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人hAdMSC購于廣州賽業(yè)公司。人BCA-1重組蛋白和人VEGF的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自R&D公司；PD98059購自Cell Signaling公司；CCK8試劑盒、結(jié)晶紫、RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自碧云天生物公司；小鼠抗人PI3K、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G均購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和細胞高糖模型 hAdMSC用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。含30 mmol/L葡萄糖為hAdMSC糖培養(yǎng)基〔10〕。

1.2.2實驗分組 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的hAdMSC為高糖對照組；25、50、75 μmol/L BCA-1處理的hAdMSC為BCA-1組(25-BCA組、50-BCA組、75-BCA組)；以50 nmol/L PD98059培養(yǎng)30 min后，再分別添加25、50、75 μmol/L BCA-1為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Erk)抑制劑組(25-Erk-組、50-Erk-組、75-Erk-組)。

1.2.3CCK8實驗 9.0×103hAdMSC接種于96孔細胞板，按hAdMSC分組情況培養(yǎng)48 h后，加10 μl CCK8試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于450 nm波長檢測吸光度值(A值)。

1.2.4Transwell實驗 按照hAdMSC分組，將1.0×104各組hAdMSC種植在直徑8.0 μm的Transwell小室內(nèi)，添加100 μl無血清高糖培養(yǎng)基。下層24孔板腔室加入500 μl含各濃度BCA-1的無血清高糖培養(yǎng)基。37℃，5%CO2培養(yǎng)6 h，收集24孔板腔室上清液，800 r/min離心5 min，計數(shù)穿過hAdMSC數(shù)目(計為Ⅰ)。4%多聚甲醛溶液浸泡Transwell小室，室溫固定2 h，0.5%結(jié)晶紫染色，IPP 6.0.1軟件計算結(jié)晶紫染色的hAdMSC數(shù)目(計為Ⅱ)。hAdMSC總遷移率=〔(Ⅰ+Ⅱ)/104〕×100%〔11〕。

1.2.5ELISA 收集各組hAdMSC上清液，人ELISA試劑盒檢測各組hAdMSC VEGF的含量。

1.2.6Western印跡 3.0×106各組hAdMSC加入RIPA細胞裂解液，12 000 r/min離心5 min；40 μg各組蛋白樣品，300 mA轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜；添加小鼠抗人PI3K抗體(1∶550稀釋)、小鼠抗人MAPK抗體(1∶700稀釋)、小鼠抗人GAPDH抗體(1∶900稀釋)；4℃孵育14 h后，HRP標記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀釋)，室溫孵育60 min；增強電化學發(fā)光劑(ECL)等步驟檢測蛋白表達條帶，分析各蛋白條帶的相對表達量〔12〕。

2 結(jié) 果

2.1BCA-1提高hAdMSC的A值 高糖對照組細胞的A值顯著低于正常對照組(0.91±0.06 vs 1.87±0.08)；25-BCA組、50-BCA組、75-BCA組hAdMSC增殖的A值逐漸升高，組間具有比較顯著性差異(1.09±0.04、1.26±0.03、1.44±0.09；F=2 392.43，P<0.01)；25-Erk-組、50-Erk-組、75-Erk-組hAdMSC增殖的A值與25-BCA組、50-BCA組、75-BCA組分別比較均具有顯著性差異(0.46±0.05、0.67±0.05、0.88±0.06；均P<0.01)。

2.2BCA-1促進hAdMSC遷移率 高糖對照組細胞遷移率顯著低于正常對照組〔(7.74±1.36)% vs (63.79±1.82)%〕；25-BCA組、50-BCA組、75-BCA組hAdMSC遷移率逐漸升高，3組之間遷移率相比具有顯著性差異〔(26.43±0.91)%、(34.70±1.04)%、(45.11±2.27)%；P<0.05〕；25-Erk-組、50-Erk-組、75-Erk-組hAdMSCs遷移率與25-BCA組、50-BCA組、75-BCA組分別比較均具有顯著性差異〔(12.23±0.98)%、(17.31±1.36)%、(25.06±1.37)%；P<0.01〕，見圖1。

2.3BCA-1促進PI3K、MAPK蛋白表達 高糖對照組PI3K(1.08±0.47)、MAPK(0.92±0.07)相對表達量與正常對照組(1.36±0.48、0.95±0.03)相比無顯著性差異(P>0.05)；細胞高糖條件下25-BCA組、50-BCA組、75-BCA組PI3K(1.23±0.45、1.46±0.27、1.62±0.76)、MAPK(0.99±0.08、1.23±0.07、1.39±0.03)相對表達量有顯著差異(P<0.01)；25-Erk-組、50-Erk-組、75-Erk-組hAdMSC的PI3K蛋白(0.75±0.76、0.95±0.25、1.13±0.91)和MAPK相對表達量(0.52±0.04、0.71±0.06、0.89±0.06)與25-BCA組、50-BCA組、75-BCA組比較，均具有顯著性差異(均P<0.01)，見圖2。

圖1 BCA-1促進hAdMSC遷移(結(jié)晶紫染色，×200)

1～8：分別為正常對照組、高糖對照組、25-BCA組、50-BCA組、75-BCA組、25-Erk-組、50-Erk-組、75-Erk-組圖2 Western印跡檢測各組PI3K、MAPK表達

2.4BCA-1促進hAdMSC表達VEGF 高糖對照組VEGF蛋白與正常對照組具有顯著性差異〔(0.62±0.10)pg/ml vs (0.33±0.19)pg/ml;P<0.01〕。25-BCA組、50-BCA組、75-BCA組VEGF蛋白含量逐漸升高，組間比較具有顯著性差異〔(0.96±0.51)pg/ml、(1.57±0.64)pg/ml、(2.83±0.22)pg/ml；F=143.21，P<0.01〕；25-Erk-組、50-Erk-組、75-Erk-組VEGF蛋白含量與相應濃度BCA-1組hAdMSC比較均具有顯著性差異〔0.23±0.14)pg/ml、(0.61±0.42)pg/ml、(0.98±0.07)pg/ml；P<0.01〕。

3 討 論

高血糖抑制血管內(nèi)皮細胞、MSC、神經(jīng)細胞等細胞活性，不利于組織再生修復。在高糖環(huán)境下提高MSC歸巢等能力，將對移植MSC，促進組織再生發(fā)揮關鍵效果。趨化因子能促進細胞歸巢〔13〕，BCA-1與基質(zhì)細胞衍生因子(SDF)-1α同屬于CXC型趨化因子亞科〔14〕，BCA-1與細胞膜上特異受體CXCR5相結(jié)合招募MSC運動，促進MSC分泌VEGF而提高傷口愈合速度〔15〕。高糖對照組hAdMSC的A值低于正常對照組，是由于高濃度葡萄糖阻斷線粒體合成或釋放三磷酸腺苷(ATP)，蓄積產(chǎn)生大量活性氧干擾細胞呼吸鏈而降低細胞增殖力〔16〕。25、50、75 μmol/L BCA-1逐漸提高hAdMSC的A值，提示BCA-1促進細胞增殖。BCA-1促進MSC成骨分化〔17〕，說明MSC表達BCA-1受體CXCR5。雖然本實驗沒有觀察hAdMSC是否表達CXCR5 mRNA，但是通過BCA-1促進細胞增殖能力，也提示BCA-1結(jié)合于hAdMSC表面的CXCR5。

骨關節(jié)炎(OA)表達的BCA-1招募白細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等炎癥細胞分布于關節(jié)囊滑膜層結(jié)締組織〔18〕。本實驗發(fā)現(xiàn)25、50、75 μmol/L BCA-1增加hAdMSC遷移，這種遷移率呈現(xiàn)劑量依賴性。乳腺癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤組織形成局部缺氧微環(huán)境，MCF-7乳腺癌細胞分泌BCA-1抑制宿主免疫監(jiān)視作用，幫助腫瘤細胞逃避免疫殺傷〔19〕。受BCA-1影響招募到乳腺癌微環(huán)境的hAdMSC發(fā)生生物學變化致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)〔20〕，對揭示腫瘤干細胞來源，抑制腫瘤生長具有非常重要的意義。本實驗發(fā)現(xiàn)高糖BCA-1組提高hAdMSC增殖活性與相關學者的研究結(jié)果基本一致〔18，19〕，即BCA-1結(jié)合于細胞表面CXCR5受體，依次激活PI3K-Erk-MAPK蛋白，促進hAdMSC分泌VEGF，維護細胞生物活性。Xu等〔21〕也發(fā)現(xiàn)CXCL13通過CXCR5/ERK介導小鼠乳腺癌發(fā)展。添加Erk抑制劑PD98059的hAdMSC增殖力相應降低，提示Erk在BCA-1對hAdMSC的作用中發(fā)揮作用。PD98059抑制了Erk蛋白，進一步抑制其下游MAPK蛋白的表達，降低hAdMSC增殖力。前列腺癌組織高表達BCA-1，靶向破壞BCA-1或其受體CXCR5表達會損害前列腺癌細胞遷移和致瘤性〔22〕。除此之外，Wang等〔23〕揭示BCA-1還會激活細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB誘導激酶(NIK)信號通路。綜上，BCA-1激活hAdMSC細胞PI3K-Erk-MAPK通路促進hAdMSC旁分泌VEGF，促進細胞增殖和遷移，但是關于BCA-1是否對hAdMSC凋亡、自噬等生物作用發(fā)揮效應，是否具有其他分子機制，還需要在今后利用動物模型、基因測序等技術進行深入探討。